基因组筛选使用CRISPR

由乔尔·麦克达德

这篇文章于2020年8月20日更新。

在您的表型中,哪些基因是重要的?许多科学家研究潜在的遗传原因并不完全知道的疾病。鉴定哪种基因对于表型很重要,可能导致丰富的额外实验,调查单个基因或整个疾病过程中的个体途径的作用。虽然CRISPR肯定不是进行所谓的“前瞻性遗传筛查实验”的第一个手段,但它肯定是最强大的。在这个博客文章中,我们将讨论如何CRISPR图书馆用于进行基因组宽的屏幕,并突出一些通过addgene公开可用的试剂。

就像这罐软糖,一个汇集的CRISPR文库是一个复杂的混合物。

是什么让Crispr如此特别?

CRISPR / CAS9对先前的基因组编辑技术的主要优势是其简单性和多功能性。CRISPR / CAS9由两种组分组成:非特异性内切核酸酶(CAS9)和单链导向RNA(GRNA)。The ~20 nucleotide targeting sequence within the gRNA is defined by the user, and it can be easily modified to target Cas9 to virtually any genomic locus, provided the target is unique compared to the rest of the genome and located immediately 5’ to a protospacer adjacent motif (PAM) sequence. Co-delivery of wild-type Cas9 and a gRNA generates a double-strand break in the target DNA, which, when repaired through error-prone非同源端连接,通常会导致目标基因内功能突变的丧失。CRISPR也可以用于激活抑制不永久修改基因组的目标基因。如果你想重温各种CRISPR技术,可以看看Addgene’sCRISPR指南

有哪些基于crispr的试剂可用于全基因组筛选?

全基因组筛选实验的目的是生成和筛选突变细胞群,以识别涉及特定表型的基因。由于CRISPR具有广泛的潜在目标序列,且易于生成含有grna的质粒,因此CRISPR可以很容易地扩大用于全基因组筛选的规模。CRISPR基因组广泛筛选实验常用慢病毒将聚合的gRNAs传递到表达Cas9的细胞。汇集的慢病毒CRISPR文库(简称“CRISPR文库”)由含有grna的慢病毒转移载体的异质群体组成,每个载体以基因组中的特定基因为靶点(见图2)。设计了单个grna在Silico.使用公共可用gRNA设计软件和合成。然后将聚合的grna克隆到慢病毒转移载体中,创建CRISPR文库。

通过将GRNA文库与CAS9的上述衍生物组合,已经创建了CRISPR文库来灭绝,激活或抑制靶基因。几个CRISPR图书馆是公开的可以通过Addgene,更多的时间增加了请记住,库的好坏取决于您使用它们做的实验!一个完善的生物学问题和实验系统是绝对必要的,以确保您选择正确的CRISPR库。

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选择适合您的CRISPR库

为您的实验选择CRISPR库时有几个因素需要考虑。

1.你的细胞来自什么物种?目前,Addgene携带的CRISPR文库针对老鼠、人类、苍蝇、E.杆菌、弓形虫基因。

2)你想做什么基因改造?Addgene携带用于基因敲除、激活、抑制和条形码的CRISPR文库。

3)你是试图针对基因组中的每一个基因,还是针对特定的一类基因?Addgene目前携带几个全基因组CRISPR库和一些亚库针对特定的人类基因类

CRISPR屏幕涉及的步骤是什么?

涉及CRISPR屏幕的步骤。首先,放大CRISPR质粒文库。接下来,这个库包装到慢病毒中。然后用该病毒转导CAS9的细胞。使用下一代测序鉴定突变细胞是筛选和“命中”。使用CRISPR库进行前进遗传屏幕是一个多步骤(见图2)。在大多数情况下,以实验使用的浓度为太低的浓度提供CRISPR文库。因此,第一步是放大你的图书馆到足以产生慢病毒的浓度一定要使用下一代测序检查你们的扩增质量。如果你得到了a现成的慢病毒制备从Addgene,你可以跳过上面的步骤!

然后用含有CRISPR文库的慢病毒转导细胞以产生异质突变细胞群,每种细胞或一组细胞含有不同基因的突变。文库可以在1质粒系统中可用,其中CAS9包括在含GRNA的质粒上,或者2-质粒系统,其中CAS9必须单独输送。

使用药物选择或荧光的细胞分选并筛选特定表型来富含突变细胞。例如,突变细胞可用于药物筛选中以鉴定赋予耐药性的基因。与未处理对照组相比,用感兴趣的药物治疗突变细胞,并在耐药性群体中分析GRNA分布。在这种情况下,“富集”的GRNA对应于在突变时赋予耐药性的基因。从这种类型的实验中的发现可以脱光,通过细胞对药物抗性的机制脱光,并且可以识别未来治疗毒性的疾病,导致不受控制的细胞生长,例如癌症。

成功屏幕的考虑和提示

新一代测序- CRISPR文库包含数千个gRNA质粒,每个质粒上只有一个独特的条形码。因此,测序CRISPR文库后扩增和筛选后需要使用新一代测序

表示-大多数文库每个靶基因包含3-6个gRNA,保持每个gRNA在群体内的分布是关键。由于特定gRNAs的富集或耗尽而导致的代表性的丧失会导致扭曲的结果。

选择单元格类型- 理论上,任何细胞类型都可以在CRISPR屏幕中使用。然而,在突变群体内保持足够的表示需要大量的细胞作为起始材料。因此,低丰度的细胞类型并不特别适合全基因组筛选。

避免误报和假阴性- 与任何实验一样,使用适当的控制,多重重复和几种细胞类型可以加强您的结果。以同一基因为靶点的多个gRNAs的富集或减少,可以有力地证明特定的基因对给定的表现型实际上是重要的。应独立验证从屏幕中击中,以确保所需的修改产生您首先筛选的表型。

通过适当的实验设计和验证实践,CRISPR库可以帮助你了解很多你感兴趣的表现型。更多关于CRISPR筛查的详细信息,请查看Addgene 2016年的出版物。”使用汇集的慢病毒CRISPR图书馆的实践考虑因素“(McDade等人。,2016)。要了解如何在其他类型的实验中使用CRISPR / CAS9,请查看我们的CRISPR质粒和资源页面


参考

McDade JR,WaxMonsky NC,Swanson Le,Fan M(2016)使用汇集的慢病毒CRISPR图书馆的实际考虑因素。分子生物学115的当前方案:。https://doi.org/10.1002/cpmb.8

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