从你的慢病毒转导中获得最多

由梅根·“政府改造”

梅根雷科

慢病毒是一种强大的实验室工具,通常用于建立稳定表达感兴趣基因的细胞系。虽然使用慢病毒,感染和选择的一般方法似乎简单,但在现实中,许多人发现使用Lentivirus耗时,困难,缺乏可重复性。阅读一些提示,以充分利用您的慢病毒转导实验。

提高病毒产量的方法:频繁传代,监测生长速率,遵循SOP

爱你的细胞,它们也会爱你

成功的慢病毒感染从您的细胞,包装细胞和靶细胞开始。糟糕的组织培养实践可以导致低滴度和转机差。应常规地将细胞系转移到足够低以防止汇合但足够高以促进细胞生长的密度。过度的培养刺激静止,细胞周期的静止阶段;静止细胞不占用核酸或表达转基因,以及主动分隔的细胞导致慢病毒滴度下降。

另一个要考虑的因素是你的文化解冻后的年龄。一般来说,传代次数越高,转染和转导效率越低。培养物只应通过20-30次,然后丢弃和解冻一个新鲜的瓶子。在许多实验室中,由于缺乏文档和实验室人员的高周转,存储细胞的历史可能有点可疑。如果您不确定正在使用的线条的背景,最好从头开始。从信誉良好的经销商获得所需细胞系的小瓶,如美国型文化集合尽可能多的冷冻早期试管。

一个经常掠夺实验室和阻碍实验的一个问题是支原体污染。支原体污染已被证明是从各种来源出现,如血清,其他细胞系或感染人员,并且可以持续到未被发现;与酵母,真菌或细菌如酵母,真菌或细菌等较大微生物的感染不同,支原体可能非常难以检测水平达到108.在培养基变得多云之前每mL的细胞。支原体与宿主细胞竞争营养,并可以改变表达受体,离子通道和生长因子导致的改变细胞系增长和行为。支原体污染的迹象可以是微妙的并且可以包括降低饱和密度,降低生长率或块状。为了确保任何基于组织培养的实验的最佳结果,实验室应常规测试支原体污染。有几个市售的支原体检测试剂盒使用检测细胞系、ELISA、荧光测定法或基于pcr的方法来检测低水平的污染。对于那些喜欢更经济的检测模式的实验室,'等。概述A自己做PCR的方法,完全具有自由可用的正面控制。

常规测试您的支原体的细胞系,如果文化已经过于融合或太老了,丢弃它。确保您正在使用健康,快乐的细胞是改善病毒生产和感染的最简单方法之一。

伟大的转导从伟大的病毒开始

如果患有幸福的细胞是成功的慢病毒感染的第一步,幸福的病毒就是第二步。在收获Lentivirus时,一些实验室更喜欢从多个时间点收集和汇集收割,而其他实验室则在用转移和包装质粒转染后再选择单个收获。多次收获策略的一个好处是您每天都会使用新鲜培养基提供生产的生产者细胞。每日中等交换有助于缓解与pH的变化相关的细胞应激和由于培养的高细胞密度。除了受益于您的细胞外,中等交易所也可能影响您收获的慢病毒颗粒的质量。研究已经证明渗透压和pH值的极端变化可以破坏病毒包膜的稳定。多重采集方法的一个缺点是,它往往导致低滴度病毒的体积更高。在这种情况下,你可能需要考虑专注于您的病毒准备

储存也可以在您的慢动动力转账的成功中发挥作用。冻融循环对慢病毒稳定性的影响取决于各种因素,例如转基因表达,使用的病毒储存缓冲液和其他实验参数。例如,通常不建议冻融,Holic等人。发现pH值为6时产生的慢病毒能够抵抗多次冻融循环。因此,除非绝对必要,否则最好避免冻融慢病毒制剂。许多实验室试图将新收集的慢病毒用于下游应用。虽然这可以确保使用最高滴度的病毒,但并不总是可行的,特别是当慢病毒原液需要滴定时。如果保存时间少于一天,慢病毒可保存在4°C.对于长期储存,病毒制剂应分成一次性的等分,并在-80储存°C.有些报道表明迅速冻结病毒干冰/乙醇在存放之前浴或液氮。

知道你的目标细胞

实验室倾向于遵循慢病毒感染的相同一般程序,产生病毒,滴注病毒(阅读本博客帖子以供提示滴答你的熊兽准备)和感染。虽然这种方法是成功感染的良好开端,但需要考虑的一点是病毒是如何滴度的。大多数滴度方法都能转导到高许可细胞系,如HEK293、H0或A549,并认为这些细胞系的结果可以转译到其他细胞系中。然而,不同细胞类型的生理差异可能使这一假设不正确。慢病毒转导最早的步骤之一是病毒包膜和靶细胞表面受体之间的相互作用。慢病毒可能的相互作用和可能的靶点由包膜蛋白决定。很多时候慢病毒载体是用非天然的包vwin668膜改造的,这个过程叫做伪型。慢病毒与VSV-G包络蛋白的假期拟合使用LDL受体感染细胞并有广泛的宿主范围。然而,病毒假型对于其他包膜蛋白质可以具有有限数量的靶标,因此在一种细胞类型中获得的滴度可能不会很好地转化为其他细胞类型。为了克服这个问题,尝试使用慢动动力准备的一系列稀释液转换。希望通过使用更多集中稀释度,您将能够克服受体表达的差异。

这一切都在混合中

甚至在慢病毒包膜蛋白附着到细胞表面受体之前,也在感染过程中发生其他重要的结合事件。这些结合事件可以通过具有病毒的带负电荷的细胞的静电排斥来损害。为了避免这种问题,转换通常采用带正电荷的聚阳离子聚丙烯。有趣的是,一项研究发现,诸如DEAE-DEEXTRAN的替代聚合物可以提高转导效率。此外,本研究发现,转导效率不仅在来自不同厂商的血清之间变化,而且在来自同一来源的不同大量血清之间变化。经常生产慢病毒的实验室可能需要考虑测试各种阳离子和血清来源,以确保最佳的转导。

是一致的

一旦您的实验室为特定的应用建立了最佳的条件,坚持使用它们!变化细胞密度、体积、孵育时间和MOI等变量都能影响慢病毒感染的成功与否。为确保高质量和可重复的结果,请始终正确照顾您的细胞系和病毒,并在遵循方案时保持一致。

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参考

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