vwin德赢娱乐平台荧光蛋白101:GFP融合蛋白 - 制造正确的连接

由Guest Blogger.

这篇职位由Guest Blogger Joachim Goedart,该职位是分子细胞学和van Leeuwenhoek中心(阿姆斯特丹大学)的助理教授。

用荧光蛋白标记感兴趣的蛋白质,以研究其功能是荧光蛋白最受欢迎的应用之一。vwin德赢娱乐平台这些融合蛋白能够观察活细胞和生物中的蛋白质。嵌合体的两种组分由DNA编码。由于研究人员可以以它们喜欢的方式产生几乎任何DNA序列,因此融合蛋白的设计和工程相对简单。然而,在保持感兴趣蛋白质的所有天然属性的同时产生融合可能是挑战性的。在本博客中,我讨论生成融合蛋白的策略并突出其设计的某些方面。

mturquoise水晶结构蛋白质尺寸和形状很重要

来自的绿色荧光蛋白(GFP)来自Aequorea Victoria其变体是遗传编码的荧光探针。其中一个限制是GFP的大小:〜240个氨基酸或约28kDa。GFP及其同源物具有β-桶结构。虽然β筒对其他蛋白质没有强烈的亲和力,但由于其尺寸,它仍可能阻断标记蛋白的功能或活性。这种类型的干扰被称为空间障碍。例如,GFP可以咬合催化位点或阻塞后翻版修饰所需的结合位点或基序。尽管存在这些潜在问题,但GFP已成功使用无数融合蛋白。

选择单体蛋白并避免粘性情况

旁边的大小,潜在的同源化和更高的顺序荧光蛋白的寡聚化vwin德赢娱乐平台是一个问题。荧光蛋白对低聚的倾向被称为“粘性”。vwin德赢娱乐平台由于荧光标签应该作为惰性发光模块操作,因此应避免任何GFP到同型偶发过化的趋势,因为它将增加蛋白质的大小。此外,它增加了耐酸性,因为它可以加倍每单位的结合位点的数量。

有几种方法测量粘性体外,超速离心或凝胶过滤是最常见的分析方法。然而,这些可能无法反映细胞中的情况。因此,临界融合的定位(例如管蛋白或Connexin)已被用作二聚化的代理(Shaner等人。,2008年- 补充图C)。然而,这些测定是定性的。有组织的光滑内质网(Oser)测定(Costanti et al。,2012年)根据oser螺纹的外观,测量靶向上的Fps靶向的Fps。该测定是定量的,目前是评估细胞中寡聚化的标准。

除了测量粘性之外,还有几个研究人员还收集了关于荧光蛋白特征的数据,例如亮度光稳定性,各种荧光蛋白的成熟时间和酸敏感性(vwin德赢娱乐平台Botman等,2018年;Cranfill等,2016年;兰伯特,2019年)。这些特征很重要,但优先于粘性较少。在我的经验中,表现为哺乳动物细胞中的vwin德赢娱乐平台单体的荧光蛋白包括:mturquoise2,Megfp,mneongreen,mscarlet(-i)和mcherry。

保持链接器序列短

在GFP应用的早期,许多人涉及荧光蛋白的空间障碍。因此,科学家开始使用感兴趣的蛋白质和荧光蛋白质之间的相对长的接头。这些是由多克隆部位编码的(I),因此由随机氨基酸序列或(II)组成,设计成形成惰性,非结构化肽,因此由甘氨酸,丝氨酸和其他小型非脂族氨基酸组成。然而,长的接头增加了蛋白酶裂解融合蛋白的可能性。

如今,具有充足的结构信息,很明显荧光蛋白的C-末端衍生自vwin德赢娱乐平台Aequorea VictoriaGFP伸出并可被认为是一个连接器(图1)。事实上,对于几种烦恼的生物传感器(黄色卡梅隆3.60埃佩克, 和百麦),可以截断供体荧光蛋白的C-末端和N-末端以增加FRET效率。

在您的蛋白质的N-和C- Termini创建融合

APT Mvenus蛋白融合通过连接荧光蛋白和感兴趣蛋白质(POI)的N-或C-末端来制备最直的融合蛋白。为了表明序列,人们经常使用像“C末端融合”的术语,但我发现这非常令人困惑,因为它可能意味着荧光蛋白位于POI的C-末端,或者POI处于C-Terminus的C-末端荧光蛋白质。我更喜欢将融合的不同部分从n到c-termin描述。例如,Lifealct-mturquoise2(质粒#36201)或mscarlet-timulin(质粒#85045)。

我们经常在多个克隆部位中使用限制酶来产生融合。对于POI-荧光蛋白融合,我们的经验是4个氨基酸的接头(PVAT,当我们在多克隆部位使用龄位点)就足够了。对于荧光蛋白 - POI融合,我们产生直线融合,没有任何接头。

当两个取向都可用时,这些融合蛋白的直接比较可能会揭示哪一个更好地保留POI的功能。例如,APT1-Mvenus融合在Golgi定位,而Mvenus-APT1融合则不存在(图2)。在Mvenus-APT1中,抑制了GOLGI定位所需的脂质基质,因此该蛋白质被误用。APT1-Mvenus Fusion显然是与之合作的更好选择。

在您的兴趣蛋白内插入荧光蛋白

我们遇到了几种蛋白质,其中POI的N-和C-末端是其天然性质所必需的。在这些情况下,由于荧光蛋白的N-和C-末端残基相对靠近(图1),因此将荧光蛋白的插入孔可以很好地工作良好(图1)。

荧光蛋白应该插入哪里?不太可能破坏POI结构的网站将最为努力。理想情况下,结构信息可以指导这一决定。在我们的经验中,插入的最佳网站是次结构(Beta-Shore或Alpha Helces)之间的环路。另外的要求是插入部位不会与其他蛋白质或生物分子相互作用。成功插入荧光蛋白的实例是CCD42的标记(Bendezú等人。,2015年)和异络型G-蛋白的α亚基(janetopoulos等,2001年Adjobo-hermans等。,2011年)。

虽然结构信息可以指导设计,但是建议生成具有不同插入的多个构造,因为很难预测哪一个将其工作如图3所示(Mastop等,2018年)。无偏见,可以通过基于转座子的策略来生成随机插入(Sheridan,2002年)。

人类Galpha13 Mturquoise.

避免蛋白质过度表达伪影

编码融合蛋白的DNA的引入将蛋白质添加到细胞内的现有蛋白质中,并可能导致过度表达伪影。这是该技术的重要缺点,并在解释结果时始终应考虑。

最近基因组编辑方法的革命(最值得注意的是CRISPR / CAC介导的HDR)启用内源基因的标记接近本地表达水平。然而,建议首先从基于质粒的系统表达融合蛋白,以评估嵌合体是否仍然是功能性的。

荧光蛋白融合的最终词汇

在产生融合蛋白之前,有几种选择需要考虑,例如,接头长度,特定荧光蛋白变体,以及添加荧光标签的位置。这些选择将确定融合程度如何反映标记的天然蛋白质的功能。可以验证融合蛋白的定位,可以将其与基于免疫荧光或蛋白质的性质的预期进行比较。

确定功能性的其他方面(催化活性或相互作用)可能是挑战性的。如果融合可以补充倒下或敲除相应的蛋白质,那就是融合表现良好的强有力。但这不是确定性证据表明融合以与本地蛋白相同的方式运作。虽然荧光蛋白融合可能永远无法与未标记的蛋白质相同,但能够看到您感兴趣的蛋白质的益处通常超过标签的潜在负面后果。


非常感谢我们的嘉宾Blogger,Joachim Goedhart!

joachim_100px.Joachim Goedhart是分子细胞学和面包车部分的助理教授Leeuwenhoek高级显微镜中心(阿姆斯特丹大学)。他开发,表征,并使用遗传编码的荧光探针。你可以在推特上关注他:@joachimgoedhart.

参考

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