Golden Gate装配升级:更多碎片,更快的装配,更高的保真度

由Guest Blogger.

这篇帖子由客人博主贡献Becky Kucera,硕士和Eric Cantor,博士新英格兰Biolabs.

金门装配限制

由合成生物社区接受,金门组装通常用于在单个“单罐”反应中组装2-10个DNA片段,形成复合物的多插入模块化组件,使生物合成途径工程和优化。但是,超过10个模块的组件的当前最佳实践通常依赖于使用不同的两步分层方法型IIS限制酶每个步骤的特殊性。酶的效率、稳定性和缓冲液的相容性等因素对单步或两步组装造成了实际限制。

我们已经减少了这些限制,通过使用工程IIS型限制性内切酶和谨慎选择连接序列引导实验获得的DNA连接酶保真数据。我们的工作表明,现在可以实现20多个碎片的组装,既高效又准确。

金门组件概述

金门组装涉及IIS型限制性内切酶(如BsaI)和DNA连接酶(如T4 DNA连接酶)的同时活动。插入物,无论是预克隆的还是扩增子形式(如上所示),其两侧都有BsaI位点,切割后产生5’4个碱基的突出。目标载体在类似IIS型限制性酶切割导致5’4个碱基外伸,与组装的插入物的外伸互补后接收组件。插入物连接到载体后,BsaI位点不再存在,允许多个片段以有序、预先确定的方式组装。如果原始插入插入到其原始载体中,它随后将被重新消化并“符合”连接到目标构造中。反应通常在37°C到16°C之间循环,为限制性内切酶和连接酶提供最佳反应温度,从而提高目标结构物的有序组装。

制定金门组件测试系统

我们的研究集中在装配的三个不同层次:

  • 高效率和精确的单插入组件
  • 中间5段或12段组装
  • 更复杂的24片段组件

单插入克隆效率是通过目的质粒获得抗生素可选标记来衡量的。抗生素选择允许高通量克隆效率测量。我们使用类似大小的Lambda扩增子插入进行了额外的效率测量,以控制抗生素选择对背景的任何抑制。通过菌落PCR对转化子的筛选,证实Lambda插入与抗生素选择标记的插入频率相同。

5-,12-和24组件系统基于正确组装A的能力lacI / lacZ结果表明,在LB/Cam/X-gal/IPTG琼脂平板上生长的β -半乳糖苷酶的编码序列成功重建lacI / lacZ录音带。通过对分离自蓝色或白色菌落的质粒进行测序,进一步确认了准确的组装。对蓝色菌落的测序显示了预期的完整序列lacI / lacZ基因(1),而对白色菌落的测序显示混合了错误组装和非常偶然的未切割或切割/重新连接的pGGA目的地质粒。

通过设定故障省略单个组分的组装反应来进行5-,12-或24片段测试系统的最终验证。由于任何组件依赖于每个模块,目的地构建和功能类型IIS限制酶的存在DNA连接酶,任何单一的遗漏都应该阻止形成一个完整的组合,从而导致一个蓝色表型。事实上,这是所有人都看到的laci / lacz.组装测试系统;如果省略任何单一成分,则没有获得蓝色菌落。

浏览质粒可用作克隆等级DNA!

成功的金门组件筛选

所有的金门组装都以组装的复杂性(插入或模块的数量)和由此产生的组装效率(转换器的数量)成反比为特征;插入的数量越多,转换子的数量就越少。为了弥补这一点,研究人员可以将含有转化子的更大体积的生长板放在选择板上。图2显示了代表性的转换板从1-,12-和24碎片组装lacI / lacZ盒,并说明如何在每个转化板上扩展1ml的生长体的体积可以操纵以产生适当水平的菌落电镀密度。

金门集合变形者

连接酶保真度和装配效率

五个片段lacI / lacZ盒式磁带组装很容易实现与高水平的变形和低背景-如此之多,以至于没有什么范围的可检测的改进方法学。为了进一步推动测试系统,我们重新设计了12个和24个碎片。

金门组装效率图这次重新设计是由原始重新工程的进步所指导的BsaI-HF®IIS型限制性内切酶并完成Potapov等人进行的T4 DNA连接酶保真研究。在NEB(1,2)。而T4 DNA连接酶是50多年来大多数生物技术克隆努力的支柱,更倾向于连接沃森克里克碱基对底物,它在一些包含错配的配对上显示了显著的活性。在金门组合过程中,不匹配的悬挑对的连接可能导致不正确的组合,因此必须小心,尽量减少这种可能性。最近,NEB的研究人员分析了在标准反应条件下,该酶对所有3-和4-碱基悬垂序列的粘聚端连接的保真度。该数据集允许定量依赖序列的连接效率和识别不匹配倾向的配对。利用这些4 bp的悬垂观测结果,设计并合成了精确的“高保真”结集,用于12和24片段版本的lacI/lacZ盒。结合bsa - hfv2 (neb# R3733),重新设计以提供改进的金门性能,对这些更复杂的组件进行了一系列优化实验。我们发现,高效率和精确的装配水平确实是可能的,在12个片段的装配过程中,99%是正确的框架内装配过程,而在24个片段的装配过程中,90%以上是正确的(图3,这些改进(在保持高水平正确装配的同时,转换器的数量增加了5- 12倍)转化为更快的装配工作流,需要更少的筛选来确认装配的准确性。保真度数据可以应用于派生类似的高保真悬挑为任何金门装配设计。

组装的碎片数量 金门装配协议* (1mL外延镀量) 每块板的装配正确 装配的保真度(正确百分比) 计算菌落总数
每2 μl组装反应 每个全组装反应**
1 5分钟,37ºC(2.5μl) 687. 100% 274,200 2742000年
1 60分钟,37ºC(2.5μl) 1623年 100% 649,200 6,492,000
12 (5分钟,37ºC - > 5分钟,16ºC)x 30(5μl) 245 99.5% 48,900 489,000.
24 (5分钟,37ºC - > 5分钟,16ºC)x 30(100μl) 78. 90.7% 783. 9792年

表1。bsa - hfv2和T4 DNA连接酶的金门组装的产量和保真度。使用图3中描述的产量的每平方积的组件的效率,从组装反应的整个产量和整个组装反应中计算出的产量。所有装配反应都有37次5分钟的终端浸泡ºC孵育或循环

*组装反应体积分别为20 μl(1,12个片段)或25 μl(24个片段)。

装配的未来

DNA装配方法是许多科学领域的重要工具,研究人员继续使用越来越复杂的实验条件测试DNA装配方法的限制。如本工作所示,构造更复杂,多片段组件的能力将促使向前推动技术的额外努力。


非常感谢我们的客人博主贝基·库克拉,M.Sc ..和埃里克·克兰特,博士。从新英格兰Biolabs.

Becky Kucera爆头Becky Kucera是一个New England Biolabs, Inc.,应用和产品开发首席开发科学家,专注于DNA克隆和组装。

Eric Cantor爆头

  • 埃里克康托尔他是一名分子生物学家,也是一名开发小组负责人,负责监督一个将新产品推向市场的团队,新英格兰生物实验室有限公司

参考文献

1.Vladimir Potapov等。通过应用连接序列依赖的保真度和偏倚分析来优化金门装配。bioRxiv(2018):322297

2.Potapov, Vladimir等人。单分子测序分析T4 DNA连接酶的保真度和DNA端连接的偏倚核酸的研究(2018)。PubMedPMID:29741723。公共医学中心PMCID: PMC6061786

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