谷歌论坛总结:NgAgo的第一印象

客人的博客

客人的博客

更新(2016年11月18日):来自多个机构的研究人员最近报告称,他们无法概括Gao等人2016年的研究结果给蛋白质和细胞的信

更新(2017年8月3日)在这篇文章中讨论的最初的NgAgo文章已经被撤回跟踪研究不能证明用这个工具编辑基因组吗

本文由客座博主Pooran Dewari撰稿。这篇文章中的任何观点都是客座博主的观点,不一定代表Addgene的观点。Addgene对所有分布质粒的选定区域进行Sanger测序,作为质量控制的一部分,但不进行功能测试。

与备受赞誉的CRISPR-Cas9共享这一舞台的最新基因组工程师是dna引导的内切酶NgAgo!我们将在一分钟内讨论NgAgo在用户方面的进展,但首先,让我们回顾一下为什么NgAgo受到关注,并记住NgAgo的基因组编辑功能才出现几个月。它需要更多的时间来优化和开发,才能真正与CRISPR展开正面交锋。

NgAgo令人兴奋的功能

首先,与Cas9不同,NgAgo不需要PAM序列来识别目标,这给了研究人员前所未有的自由来识别任何DNA序列。第二,NgAgo的靶标特异性是由DNA引导序列决定的,而不是像Cas9那样由RNA引导。第三,它可以用来瞄准基因组中“困难的”gc丰富区域,这些区域似乎对Cas9的裂解有抗性(1)。

CRISPR-Cas9和NgAgo基因工程方法各有优缺点(2)。NgAgo DNA指南价格低廉,可以通过简单的PNK反应在室内进行5 ' -磷酸化,也可以从一家公司购买5 ' -修饰。然而,与RNA引导不同的是,它不能从细胞中的质粒中产生。此外,在体外NgAgo/ssDNA的组装需要在55℃孵育°C -对哺乳动物细胞来说是一种危险的、非生理的温度,它会降低该酶的内切酶活性。在活的有机体内在美国,只有新生的NgAgo蛋白(可能在合成过程中)才能在ssDNA引导下形成复合物。因此,研究者必须用5’-P-ssDNA引导物和NgAgo表达质粒共转染细胞来编辑基因在活的有机体内

自己试试NgAgo吧

另一方面CRISPR-Cas9在多个模式生物中广泛成功(3.)在于它的多功能性交付方法。研究人员可以方便地转染/注入细胞在体外预组装Cas9/gRNA复合物或与引导RNA和Cas9表达质粒。然而,Cas9引导RNA的传递依赖于克隆到载体或在体外合成,这可能是不可取的,如果一个人必须针对多个地点在一个单一的实验。此外,NGG PAM序列可能并不总是在距离目标位点最佳距离时可用。例如,NGG可能不存在于基因组的at丰富区域或仅仅在终止密码子之后(这是c端表位标记所必需的)。

NgAgo调查

自2016年5月首次发表于Nat Biotech (1), NgAgo受到了广泛的关注,该质粒已被全球各地的实验室请求了近400次。研究人员一直在兴奋地测试NgAgo的基因组编辑应用程序。那么,到目前为止,NgAgo的表现如何?几周前,我浏览了NgAgo谷歌论坛,在那里人们写下了他们使用新方法的经验,并寻求建议/技巧。从论坛上的讨论来看,许多研究人员似乎很难利用这项新技术实现基因分裂。为了深入了解研究人员对NgAgo的看法,我进行了一项调查调查并询问研究人员是否测试并比较了NgAgo和CRISPR-Cas9。调查分为两个部分,第一部分询问研究人员认为这两种方法中哪一种更成功,第二部分询问有关受访者使用的NgAgo协议的基本问题(转染方法,每次转染每种成分的数量等)。

以Pooran的NgAgo调查为例

调查结果

NgAgo关于Indels和knocin的调查结果

截至2016年8月1日,共有165名研究人员回应这项调查。当被问及是否可以用NgAgo检测到indel(一种基因破坏能力的指示)时,88名受访者中有一人确认在目标位点成功形成indel。此外,41名受访者试图使用该技术进行表位标记,但只有其中一人能够检测到目标位点上的标签敲入。总的来说,64%的研究人员对新方法不满意,65%的研究人员希望等到其他人为他们最喜欢的模型系统优化NgAgo协议时再采取行动。绝大多数受访者(70%)使用了基于脂质体的方法将NgAgo成分送入细胞,Gao等人使用了相同的方法,2016 (1)。

查看Pooran的NgAgo调查的完整和最新结果

的关键信息

虽然大多数受访者一直在努力用NgAgo实现基因组编辑,但这并不意味着这项技术已经死水了。乐观的一面是,一些受访者成功实现了indel生成和表位敲入,这表明NgAgo确实可以优化哺乳动物细胞的基因组编辑。然而,在这里调查的大多数研究人员都无法使用NgAgo系统实现indels,这表明使用indels非常棘手,优化起来也很麻烦。一个原因可能是所谓的外来5 '磷酸化的ssDNA引导物的不稳定性,它可能会被细胞机制迅速降解,在细胞中留下少量活跃的NgAgo/ssDNA复合物。如原文所述,为了获得更大的效果,研究人员必须使用ssDNA引导进行重复转染,尽管许多人可能会发现这很不方便。另一个可能的原因是,成熟的NgAgo蛋白无法加载ssDNA引导。在翻译过程中,可能只有一小部分新生的NgAgo蛋白分子能够与ssDNA形成功能复合物,从而导致下游编辑效率低下。

总的来说,到目前为止,根据受访者的“最终结论”,我们需要更多时间来优化NgAgo,然后才能得出任何主要结论:


ngAgo调查结果

也就是说,许多人在使用NgAgo系统时遇到了困难。如果你已经成功了,我鼓励你与研究界分享你的结果和协议。一些可以让你得到结果的好地方包括:

这可能需要一段时间来优化NgAgo为你最喜欢的模型系统,但基因编辑领域迅猛发展,它不会是一个惊喜,如果有人想出了一个突变NgAgo(或一种新的核酸内切酶)蛋白能够形成一个复杂的和一个5 ' -P-ssDNA指导在室温下。在那之前,那些有幸使用NgAgo的人应该在NgAgo论坛、博客或下方评论区与科学界分享技巧和协议细节。继续移液,快乐地编辑基因组!

看看杜德纳实验室的其他阿尔戈纳特质粒


非常感谢我们的客座博客poan Dewari!

pooran dewari

Pooran Dewari是爱丁堡医学研究委员会再生医学中心(CRM)的博士后。他的研究兴趣包括优化脑细胞的基因组编辑方法和理解脑肿瘤生物学。不剪DNA的时候,他会尝试一些随机的事情(101堂西班牙语课,c++,吉他,摄影),并且经常梦想爱丁堡的一个阳光明媚的日子。

参考文献

1.高峰等。“利用格里高利·阿尔戈aute Natronobacterium gregory yi Argonaute进行dna引导的基因组编辑。”自然生物技术(2016)。PubMedPMID: 27136078

2.伯吉斯,肖恩。,等。“关于NgAgo问题。”《蛋白质与细胞》(2016)

3.“NgAgo:用dna引导的酶编辑基因组。”DNA-scissors(博客)。博客网站

4.xu, Patrick D., Eric S. Lander, and Feng Zhang。“CRISPR-Cas9基因工程的开发和应用。”细胞157.6(2014): 1262 - 1278。PubMedPMID: 24906146。公共医学中心PMCID: PMC4343198

Addgene博客上的资源vwin.com mobile

在Addgene.org上的资源

主题:CRISPR,德赢vwin

留下你的评论

分享科学变得更容易了……订阅我们的博客

订阅