哈弗兰肯机构,一个可视化单分子和新生肽的新型成像工具

由Alyssa Cecchetelli

部分稳定的支架,部分表位结合区域,都融合到一个荧光蛋白。“弗兰肯身体”,就像臭名昭著的弗兰肯斯坦一样,是通过将不同的部分嫁接在一起而形成的。通过结合抗体探针的两个优化元素,科学家现在可以更容易地看到单个分子和新形成的蛋白质。

GFP在成像方面的局限性

虽然GFP一直是一种学习蛋白质的强大强大的工具体内它确实有一些局限性.GFP具有长蛋白质成熟时间,限制其用于成像蛋白质的整个生命周期的用途。这使得科学家几乎不可能使用GFP进行图像新生蛋白质。此外,GFP标签大,暗淡,永久地连接到蛋白质中,使它们难以扩增和长时间的图像。

基于抗体的探针是一种解决方案吗?

为了解决这些限制,科学家们利用抗体进行标记。不同的抗体结合不同的称为表位的蛋白质序列,科学家可以用这些来标记他们感兴趣的蛋白质。抗体探针,如抗原结合片段(Fabs) (波特1959年),单链可变片段(scFvs) (Inbar等人,1972年)融合到成熟的荧光团,可以染色和亮起表位标记的蛋白质体内。然而,这些探针的制造成本很高,难以在生命系统中使用,而且一旦进入细胞内往往无法正常折叠。

开发HA frankenbody

为了解决这些基于抗体的探针的问题Stasevich实验室采用另一种策略开发了一种基于遗传编码抗体的探针,用于检测在不同细胞环境中广泛使用的HA表位。他们称这个探针为HA frankenbody (赵等,2019).

为了开发HA Frankenbody,Stasevich实验室测试了几种SCFVS支架,先前被证明可以折叠和在活细胞中起作用。为了使这些特定于不同目标的支架,科学家们将它们融合给称为识别和结合特异性表位的抗体的互补确定区域(CDR或环)的序列(Ewert等人,2004年).这种scFv杂交提供了支架上的探针结构和稳定性,以及对cdr上HA表位的特异性。

为了可视化标记HA表位的蛋白质,实验室将一个荧光蛋白融合到杂交抗HA scFvs上。荧光蛋白的加入使得科学家可以很容易地观察到探针在活细胞中结合的标记蛋白。

在他们的概念证明实验中,Stasevich实验室观察到GFP标记的HA frankenbody与mCherry, 4xHA标记的组蛋白(H2B)在U2OS细胞中共定位。他们随后表明,HA frankenbody探针也可以结合1xHA标记的组蛋白和线粒体蛋白意大利面条怪物哈(SMHA)包含10xha标记。这些实验表明,HA弗兰肯体可用于放大荧光信号体内成像:与1xHA相比,10xHA标签的荧光信噪比增加了5倍。

HA Frankenbody用蛋白质定位的示意图最后,研究人员发现,HA frankenbody对敏感细胞(如活神经元)有效,可以与其他荧光蛋白和标签(如mCherry、HaloTag和SNAP-tag)融合vwin德赢娱乐平台多色成像

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你还能用HA frankenbody做什么?

HA Frankenbody的另一个大优势是,活细胞中的几分钟内容仍然是HA表位,这意味着科学家可以随着时间的推移跟踪单个HA标记分子的运动和定位。

Stasevich Lab还证明了HA Frankenbody可以有效地用于跟踪U2OS细胞中的单个mRNA翻译。HA很小,只有9个氨基酸,因此它被核糖体快速翻译。此功能提供了HA Frankenbody的能力,该功能将新生HA标记的蛋白质结合。

最后,HA frankenbody可用于整个生物体的成像。研究人员利用HA frankenbody在80分钟的时间过程中成功地追踪了一个发育中的斑马鱼胚胎的细胞核。

通过将稳定的支架和HA结合区域缝合在一起,Stasevich实验室创建了一种通用工具,可用于可视化各种蛋白质动态体内.将来,这种拼接技术可以应用于其他表位和脚手架,以建立更强大的FrankenBodies。


参考

Ewert, S., Honegger, A., & Pluckthun, A.(2004)。提高抗体在细胞外和细胞内应用的稳定性:CDR移植到稳定框架和基于结构的框架工程。方法34(2),184-199。PubMedPMID: 15312672

Inbar, D., Hochman, J., & Givol, D.(1972)。重链和轻链可变部分的抗体结合位点定位。美国国家科学院院刊69.(9),2659-2662。PubMedPMID:4560694.PubMed Central Pmcid:PMC427010

r·波特(1959)。用结晶木瓜蛋白酶水解兔y-球蛋白和抗体。生物化学杂志73.(1948), 119 - 126。PubMedPMID: 14434282.PubMed Central Pmcid:PMC1197021。

赵,N.,Kamijo,K.,Fox,P. D.,Oda,H.,Morisaki,T.,Sato,Y.,... Stasevich,T. J.(2019)。用于在体内成熟和成熟的HA标记蛋白的成像的遗传编码探针。自然通讯10(1) PubMedPMID: 31270320.PubMed Central Pmcid:PMC6610143。

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