利用细菌毒素的等位基因交换

客人的博客

这篇帖子由博雅拉撒路,博士后研究员贡献哈佛大学

在细菌中产生染色体突变的方法多得惊人,多到让人很难决定采取哪一种方法。在染色体中引入突变的一个快速和简单的方法是用抗生素耐药性盒式磁带破坏基因的表达。这会在染色体上留下“疤痕”,有时会干扰周围基因的表达。然而,有一些方法可以制造无疤痕突变,即不会在染色体上留下任何不想要的疤痕。

这些方法大致分为两类:依赖于外源酶的方法和使用内源性同源重组的方法。

使用外源酶修饰细菌基因组:Lambda red和CRISPR

经过20年的发展,Lambda Red Refombineering.它使用了从Lambda噬菌体驯化的酶,可以说是应用最广泛、最有效的一种(Thomason等,2014年)。最近几年,CRISPR-Cas9技术也帮助创造无疤痕突变,不管是在独立的系统中(Jiang et al., 2013)以及提高λ红色效率的人(Pyne等人,2015年;Reisch and Prather, 2015)。

这两个系统都很强大,但它们依赖于外源酶,需要多个转化和质粒治疗步骤,并可能产生脱靶突变。

利用反选择标记和同源重组修饰细菌基因组

作为替代,内源性同源重组酶也可以实现所需的基因组改性。这种技术经常称为等位基因交换。这里,从共轭质粒引入的突变等位基因取代了染色体拷贝。这是一种多功能技术,并且不太容易发生偏离目标突变。最终,成功的等位基因交换需要两个顺序同源重组事件,但由于这些事件很少,每个事件都需要选择。

这两个步骤是(图1):

  1. 最初的质粒整合步骤(所谓的“单交叉”),其结果是一个半二倍体。这可以通过从载体中选择抗生素抗性标记来实现(abR,图1)。
  2. 分解步骤(“双交叉”),它导致所需的突变和载体主干的切除。这一步需要“反选择”,这意味着选择是为了失去一个特定的表现型(使用(见图1,后面将进一步讨论)。等位基因交换的步骤包括质粒整合和质粒主干的切除

反选择标记:

用来识别双交叉的反选择标记是什么?最常用的反选择系统依赖于基因的产物枯草芽孢杆菌(HMELO等人。,2015年)基因产物是一种蔗糖酶,其将蔗糖转化为有毒代谢物。经过双交叉的细胞不会包含,让它们在蔗糖中生长。只通过单一交叉的细胞仍然包含也不会在蔗糖上生长。

一个受欢迎的浓度矢量是PDS132基于等位基因交换向量。这个向量包含sacB,耐氯霉素盒,R6K起源的复制只允许在携带噬菌体pir蛋白的宿主中复制。这允许含pir的供体和感兴趣的受体之间的结合。因为pDS132不能在受体中复制,所以分离出的唯一抗生素耐药性菌落是那些等位基因交换载体进行单交叉并整合到基因组中的菌落。随后对蔗糖的选择将识别出双交叉。

这可以是生成精确,未标记的突变体的有效方法,但它经常需要相当大的优化来确保强烈的反选择。轶事,也有大量的用户到用户变异性,并且在某些情况下,可能发生反选择逃生:单个交叉菌落可以获取在蔗糖上生长的能力,也许是失活。

用于反选择的细菌毒素

在2015年,陈格利用一组细菌毒素促进高效recombineering(Khetrapal等,2015)。它们为λ红创造了含有八个细菌毒素基因中的一种孤立的植物的载体大肠杆菌或者psuedomonas铜绿假单胞菌。这些毒素是VI型分泌效应毒素、毒素-抗毒素型毒素和噬菌体毒素的混合物。他们假设,那些专为毒性而进化的基因会允许更强的反选择,而不是仅仅为了这个目的而进化的基因。sacB)。

重要的是,为了防止毒素在第二交叉步骤之前被激活,他们测试了鼠李糖诱导启动子和阿拉伯糖诱导启动子下毒素的表达。绝对必要的对毒素表达的紧密控制是绝对必要的,因为毒素的漏渗表达可以选择毒素本身的突变(导致反选择逃逸)。犀牛感应系统具有很好的特征,非常紧张(Giacalone等,2006)陈实验室展示了极好的反选择,使非常有效的重组成为可能。

我们受到这项工作的启发,并寻求开发这些等位基因交换的负选择标记。

为此,我们对pDS132进行了以下修改(Philippe等,2004):

  1. 更换了含有希特拉帕纸上三种毒素之一的盒式磁带。我们选择了这三种毒素,以便至少有一种可能在一系列致病性变形杆菌中有用。我们将毒素基因置于鼠李糖诱导启动子的控制下,尽管Khetrapalet al。还证明了阿拉伯糖促进剂也有效。
  2. 鼠李糖的诱导依赖于转录激活因子rhaS。为了允许在没有内源性鼠李调节子的情况下操纵细菌,我们插入了一份副本rhaS具有强合成核糖体结合位点(使用Salis组的在线计算器)(Espah Borujeni等人,2014)
  3. 用一个通用的合成MCS取代pDS132 MCS(在DNA调谐程序的帮助下设计)(Latynski和Valentovich 2014)。我们常规地使用商业等温组装主混合将纯化的扩增子的上游和下游直接克隆到切割载体中。
  4. 强转录终止子BBa_B1002的引入(来自IGEM.),减少进入MCS的转录读通,以促进有毒产物的克隆。
  5. 为了便于对天然的氯霉素耐药菌株进行操作,我们还包括了对庆大霉素耐药的版本(从TP997放大)。

色素蛋白在大肠杆菌中的表达我们验证了这些载体,我们称之为“pTOX”在一个广泛的革兰氏阴性肠杆菌科,包括大肠杆菌O157: H7,福氏志贺氏菌,阴沟肠杆菌,Serratia marcescens.并创建了几十个删除和插入与这个系统(Lazarus等,2019)

另外,为了便于修改菌株,其中难以困难,我们也包括在内Ptox的版本编码两个可见的蓝色或洋红中的一个发色蛋白(图2)(Liljeruhm等人,2018)。这个系统是一个很好的确认成功的单一交叉-约48小时后,产生的菌落微妙地变成蓝色或品红。这在第一次优化偶联不太好的菌株时特别有价值。这是因为在这些情况下,结合的效率非常低,结果产生的菌落不是真正的单一交叉,而是自发的抗抗生素克隆。但如果它们是蓝色或品红的,它们就是真的!

计划进行等位基因交换实验?在这里找到pTOX质粒!

继续开发新的等位基因交换载体

等位基因交换是一种很好的技术对细菌基因组织无缺骨的改性。它可以完成大的缺失,插入甚至精确点突变。我认为每种细菌遗传学家的工具箱都会有一个地方。

根据感兴趣的生物体的生长速度,从引物到达的那天起,可以在5天内完成所需的染色体修饰。

Counter-selection与彻底改变了等位基因交换。即使现在,只有一半的实验室改用pTOX。然而,我们认为它有明显的优势,并希望不断发展的等位基因交换载体将产生一系列伟大的选择,并继续提高这一多功能技术的效率。


非常感谢来自哈佛的客座博主Jacob Lazarus。

雅各拉撒路头像杰克在宾夕法尼亚大学获得了细胞和分子生物学的医学博士学位,并在麻省总医院接受了成人医学和临床传染病方面的培训,现在他是那里的主治医生。他在哈佛大学的Matthew Waldor实验室进行博士后研究。现在他有了一个有效的等位基因交换系统,他非常兴奋地利用它来探索与医院相关的革兰氏阴性细菌是如何对抗生素产生耐药性的!


参考

Espah Borujeni, Amin, Anirudh S. Channarasappa和Howard M. Salis。翻译率是由位点可达性、选择性RNA展开和上游备用位点滑动之间的权衡决定的。核酸的研究42.4(2013): 2646 - 2659。PubMedPMID:24234441。公共医学中心PMCID:PMC3936740

Giacalone, Matthew J,等。“在大肠杆菌中使用一种基于鼠李糖的严格调控和可调启动子系统表达有毒蛋白质。”生物技术40.3(2006): 355 - 364。PubMedPMID: 16568824

Hmelo, Laura R.等人。铜绿假单胞菌基因组的精确工程与两步等位基因交换自然的协议10.11(2015):1820。PUBMEDPMID:26492139。公共医学中心PMCID:PMC4862005

江,温岩,等。“使用CRISPR-CAS系统的细菌基因组的”RNA引导编辑“。自然生物技术31.3(2013):233PMID:23360965。公共医学中心PMCID: PMC3748948

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Latynski美国,瓦伦托维奇LN。“DNA调谐器:用于构建分子载体多联分子序列的计算机程序”。白俄罗斯国立大学生理生化与分子生物科学学报。9.1(2014):148-153。(访问2019年2月28日]。

Lazarus,Jacob E.等人。“新的等位基因交换载体套件,用于植物基因组织无缺骨的改性。”应用与环境微生物学(2019): aem - 00990。PubMedPMID: 31201277

Liljeruhm, Josefine等人。"为细菌合成生物学设计真核色素蛋白调色板"生物工程杂志12.1(2018):8。PUBMEDPMID: 29760772。公共医学中心PMCID:PMC5946454

Philippe, Nadège,等。pCVD442基因交换自杀质粒的改良质粒51.3(2004):246-255。PubMedPMID: 15109831

派恩,迈克尔E等人。“将CRISPR/Cas9系统与lambda red重组技术结合,可以简化大肠杆菌中的染色体基因置换。”达成。环绕。Microbiol。81.15(2015): 5103 - 5114。PubMedPMID:26002895.。公共医学中心PMCID:PMC4495200.

Reisch,Chris R.和Kristala LJ Prather。“在大肠杆菌中的基因组编辑的”无瘢痕(无疤痕CAS9辅助重组)系统“。”科学报告5(2015): 15096。PubMedPMID:28060411.

Thomason,Lynn C.等人。“重组:使用同源重组的细菌基因工程。”分子生物学的当前协议106.1(2014): 1 - 16。PubMedPMID: 24733238

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