热质粒和病毒制备 - 5月2021年

每隔几个月，我们通过我们突出了存储库中的新质粒和病毒准备的子集热质粒物品．这些文章提供了近期质粒沉积物的简要摘要，我们希望他们能让您更容易地找到并使用所需的质粒。

这是你在这篇文章中找到的内容：

• 汇集库在SARS-COV-2中研究抗体逃生
• 重组氨基酰tRNA合成酶抗体
• 用于酵母生物生产途径的纳米隔间
• Crisprcler
• 新的现成的病毒制剂

通过突变扫描在SARS-COV-2中映射抗体逃逸

经过Seth Kasowitz.

由于世界各地部署了多种基于抗体的疫苗来对抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)，该病毒可能获得突变以逃避这些治疗。Jesse Bloom的实验室Fred Hutchinson癌症研究中心开发了一个包含病毒刺突蛋白受体结合域(RBD)所有可能氨基酸突变的混合质粒库。

图1所示。(A) SARS-CoV-2 RBD DMS文库的生成和测序。从Starr等人细胞。，2020．(B)利用酵母展示库绘制抗体逃逸突变。从Starr等人科学。，2021年．

SARS-COV-2通过结合人血管紧张素转换酶2（ACE2）细胞表面受体来感染宿主细胞。负责结合ACE2的尖峰蛋白RBD是大多数抗SARS-COV-2抗体的靶标。在图书馆中，每个质粒编码突变的穗蛋白和条形码，并设计成使得SARS-COV-2尖峰RBD显示在酵母细胞的表面上。Bloom Lab使用库来识别不干扰ACE2结合的RBD突变，而是通过特异性抗SARS-COV-2抗体的影响识别（图1B）。这种方法可以通过能够快速评估抗原漂移来增强病毒监测。

Starr等人细胞。2020。https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.08.012

Starr等人科学。2021。https://doi.org/10.1126/science.abf9302

用于氨基酰基TRNA合成酶的验证的重组抗体工具箱

经过凯特哈滕

靶向14个氨基酰基合成酶（AARS）的重组抗体已经创建，其特征，并由其验证格拉德实验室．最近的研究表明aars参与炎症和自身免疫性疾病，因此这些被验证的抗体工具可以用来研究aars在这些过程中的作用。

为了产生抗体工具箱，它们使用合成人SCFV文库筛选抗体候选物，并通过ELISA，均匀时间分辨荧光和悬浮珠测定表征它们（图2）。在找不到交叉反应性后，抗体候选者接受了亲和筛选，以选择慢速粘合剂粘合剂。使用HEK293细胞裂解物通过IP-MS验证最佳候选者，其中抗原将是其原始构象。由于许多AARS存在于多重TRNA合成酶复合物中，因此该团队研究了所生成的抗体是否可以束缚这些AARS。他们发现抗体能够在三种不同的细胞系中免疫沉淀整个络合物。Gräslund实验室计划通过为另外的氨基酰基TRNA合成酶产生抗体来继续工作。

图2:悬浮珠法测定scFVs与aaRS抗原的特异性结合。从图片PREGER等人。，2020。

Preger等人，生物化学杂志2020。https://doi.org/10.1074/jbc.ra120.01289

新型蛋白笼在酵母生物生产途径中提供简单的酶保护

经过加布里埃尔Clouse

Claudia Vickers的实验室通过使用鼠多马卡韦病毒样颗粒（MPYV VLP）创造了一种用于将酵母中的蛋白质传送的新型纳米组分。这种人工纳米粒子可以保护蛋白质免受细胞中不利的相互作用，通过稳定速率限制酶来改善生物合成途径产率。在该方法中，主要衣壳蛋白VP1与含有VP2C的融合蛋白和感兴趣的蛋白质（POI）共表达。VP2C融合蛋白锚固到VP1，其自组装成包装感兴趣蛋白质的隔室（图3）。

图3:MPyV系统的原理图表示。图片来自Cheah等人，2021年。

通过监测GFP降解情况验证该方法后，利用该蛋白室优化D-glucaric acid的生物合成。这种MPyV系统在此途径中包含了一种限速酶(肌醇加氧酶)，在提供酶保护的同时仍然允许底物和产物自由扩散进入或离开蛋白质室。使用这种封装酶的酵母多产生20%的d -葡萄糖酸，表明MPyV系统可以通过封装单一酶来提高代谢途径的产量。与以往的研究相比，MPyV系统提供了一种简单、有效的方法来保护驱动生物合成途径的单一酶。

Cheah等人，bioRxiv 2021年。https://doi.org/10.1101/2021.01.30.428974

Crisprcler

经过德赢在线

以下是近期Crispr质粒的一些亮点。找到从加法中获得的所有CRISPR质粒，前往我们的CRISPR质粒和资源页面．

• 一个新系统使用灯去激活机油包裹gRNAs在几秒钟内。
• 一种基于CRISPR的谱系追踪工具捕获含量为0.001％的人口的克隆。
• 由于Cas9的indel生成可以以稳定的速度发生，因此科学家发现了一种使用embel累积来测量时间的方法。这些具有不同启动子的质粒驱动Cas9的表达在这项研究中使用。
• 这zcas9i克隆套件是一种植物克隆试剂盒，其包含一系列载体和DNA模块，用于组装CRISPR / CAS9构建体。ZCAS9i是一种高效的内含子优化的SPCAS9编码基因。
• Slugcas9.是一个紧凑的Cas9 Ortholog来自葡萄球菌lugdunensis识别出NNGG PAM并对SACAS9具有可比的活动。
• 一个新的酵母诱导克里普利图书馆- SAMP133目标S.．酵母无水四环素诱导gRNA表达的每个基因有6-12个引导子的基因。
• 三个新的防克隆发现抑制了吗S.．金黄色葡萄球菌Cas9是一种更小更容易传递的Cas蛋白，但到目前为止还没有识别出多少抑制剂。

来自病毒服务的新增功能

经过Jason Nasse.

我们定期从我们的质粒收集中添加新的病毒分株以提供即用型病毒准备．以下是最近几个月的一些新病毒准备方法：

• 轴突瞄准GCaMP6f来自林天的实验室可以使用Serotype AAV1。
• 来自珍妮莉亚农场的GCvwin668aMP8病毒载体Genie项目已经到了！我们现在提供几个版本GCaMP8向量在serotypes aav1和aav5。AAV9 Preps和更多AAV1版本将很快发布。
• 用一个矢量可视化轴突投影和推定的突触前终端。AAV hSyn FLEx mGFP-2A-Synaptophysin-mRuby从Liqun Luo的实验室表达膜系GFP以增强轴突标记，突触素标记mRuby以丰富突触前标记。现在有血清型AAV1!
• 新的INTRSECT病毒准备可用!我们正在扩大准备使用病毒制剂的库存戴瑟罗斯实验室intersect项目。我们现在有40多个intersent 2.0.项目向量可用作现代化的病毒准备，并在途中提供更多。
• S5E2含有载体的调节元素jordane dimidschsteind实验室在含有皮质中间神经元的Parvalbumin中选择性表达。我们现在提供了现成的表达GCaMP6f的AAV载体。PV中间神经元的钙瞬态成像AAV-S5E2-GCAMP6F作为AAV1血清型的随时可用的病毒制剂。
• 利用表达细胞质靶向tdTomato和突触前靶向突触素标记eGFP的AAV载体区分树突神经突起和轴突神经突起。AAV phsyn1（s）-flex-tdtomato-t2a-sypegfp-wpre从鸿奎曾的实验室目前可用作AAV1血清型随时可用的病毒准备。
• 针对GCaMP6s突触来自不是拉森实验室现在已经有现成的AAV5病毒载体。synaptophysin标记的gcamp6在突触前末端富集，为精细结构的钙动力学成像提供更好的噪声信号。
• 我们已经将依赖重组酶的病毒选择扩展到现在包括FLP依赖的Dreaddsvwin668病毒载体。来自Gether实验室的抑制性和兴奋性dreadd现在都可以作为AAVrg血清型的现成AAV载体。