热质粒- 2020年8月

通过各种Addgenies

火焰每隔几个月,我们通过我们的热质粒物品。这些文章提供了近期质粒沉积物的简要摘要,我们希望他们能让您更容易地找到并使用所需的质粒。如果您想写下最近的质粒存款,请注册在这里

这是你在这篇文章中找到的内容:



基于酵母的蛋白质演化后更快的催化

经过乔安妮·卡门

马特奥桑切斯和爱丽丝Ting使用了一个生物技术工具来优化另一个。作者创造了一个基于酵母的定向进化方法有一些显着的改进。定向的进化技术模仿了序列的自然选择,其演化了蛋白质的可测量特性。作为概念证据,桑切斯和婷寻求提高烟草蚀刻病毒蛋白酶(TEV)的催化效率,一种用于切割的高度序列特异性蛋白酶亲和标签从纯化的重组蛋白在小和大规模。

这种新技术涉及在胞质溶胶(代替酵母细胞外表面上的选择,这使得能够跟踪荧光蛋白的蛋白酶活性 - 不需要亲和纯化!该团队使用其他分子技术来引入TEV切割的时间调制,并改善系统的效用,以便与TEV的低亲和力变种一起使用。新系统已被证明为其他靶标蛋白的演变工作,对您的学习可能有用。

找到在Addgene中设置筛选系统的质粒!

酵母FACS进化平台示意图
产生TEV蛋白酶变种的进化平台示意图。TEV蛋白酶的催化作用允许转录因子进入细胞核,调节mCitrine基因的转录。mCherry是构成式表达。然后细胞被培养和FACS分类。图片来自Mateo Sanchez和Alice Ting。

Sanchez MI等人,Nat方法。2019.https://doi.org/10.1038/s41592-019-0665-7


优化哺乳动物细胞中标记结构和隔室的荧光工具

经过安吉拉Abitua

基因编码的荧光蛋白常被用于标记细胞内生物vwin德赢娱乐平台分子的特定结构、隔间或特定定位。然而,有时这些荧光蛋白可能无法定位到正确的位置,这vwin德赢娱乐平台可能会提供误导信息,使人们知道一个结构或蛋白质在细胞内的确切位置。Goedhart实验室、Gadella实验室及其合作者正在努力改进基因编码荧光标记,以标记细胞内的特定结构。

已标记HeLA细胞的显微镜图像
用编码FPs的质粒转染HeLa细胞,质粒标记来自p63(1-29)和Lck的质膜靶蛋白序列。图片来自Chertkova等人。,2020年

在他们的Biorxiv帖子,作者生成并描述了几种改进的基因编码荧光标记物,标记为mTurquoise2、mNeonGreen和mscarlett - i,用于标记细胞内的一系列特定结构。例如,为了改善荧光蛋白的核定位,他们发现添加三个核定位信号或包含与Histone 2A或2B的融vwin德赢娱乐平台合可以导致明亮的靶向表达,同时最小化非特异性标记。为了标记质膜,他们测试了不同的目标序列以提高选择性,发现最好的基序来自于Lck基因。在标记哺乳动物细胞微管时,作者发现这些标记物的高表达会导致非特异性标记。他们生成了EB3标记的质粒来标记微管的生长尖,以及MapTau标记的质粒来标记整个微管。

找到这些荧光哺乳动物细胞结构标记质粒在Addgene!

Chertkova, AO等,bioRxiv。2020.https://doi.org/10.1101/160374


纳米级 - 有一种简单的方法!

经过米歇尔·克罗宁

的好处nanobodies超过常规抗体不能被忽视。与抗体相比,纳米级尺寸较小,更耐用,通常更容易克隆,表达和纯化。纳米级易于在胞质溶胶中表达大肠杆菌然而,纳米体蛋白质往往会被卡在包涵体中。岩垣隆行、原纪美子和梅村一雄都有描述了一种简单的方法减轻了包含体问题并使纳米体生产E.coli.就像遵循DNA迷你准备协议一样简单!

首先,作者通过修改创建了pMAK骨架pmal-t-avi-his / bira,矢量常用于在活的有机体内通过Bira和Avitag生物素化。pMAK包含MBP的信号肽,然后是所需的纳米体(NB)序列,一个AviTAG和6xHis标签。MBP信号肽允许NB被输出到细菌的周浆,在那里它可以分泌到上清。在pMAK中生成了四个含有不同纳米体(NB)的质粒:

pMAK461-64质粒在SHuffle T7 Express competent中表达E.coli.(NEB)使用IPTG诱导。对于生物素酸酯纳米甲酸纳米阳红,作者使用溶解在DMSO中的生物素,其允许生物素和生物素-4-荧光素以更高的浓度溶解,并导致均匀的Nb生物素化。一旦诱导,使用Ni-NTA磁珠,可以通过单步固定金属离子吸附色谱(IMAC)容易地纯化NBS。

pMAK461-64的纳米体生产流程
纳米体表达和纯化的工作流程。

Iwaki等人,Protein Expr Purif, 2020。https://doi.org/10.1016/j.pep.2020.105607


一种用于人多能干细胞的新多路复用CRIPRI和CRISPRA系统

经过德赢在线

CRISPR基因干扰(CRISPRi)和基因激活(CRISPRa)通过特异性引导RNA(GRNA)序列来调节几乎任何基因表达的很好方法。但这些方法依赖于DCAS9和GRNA的持续表达。此表达可以根据转换器设计和递送而显着变化。

为了克服人类多能干细胞(hPSCs)中的这些变异,林迪舞巴雷特的实验室博德研究所开发的荧光标记技术Piggybac.带菌者,制服和持续单独或多路复用GRNA和DCAS9融合的表达。使用AAV1将DCAS-Krab活化剂和DCA-VPR阻遏物引入HPSC基因组中并含有EGFP报告器。在HPSC中的DCAS9-Krab活化剂或DCAS9-VPR阻遏物的表达也由十氧环素诱导促进剂驱动。GRNA Piggybac质粒包括MRFP记者。通过该系统,它们可以量化和跟踪表达DCAS9和GRNA的单元格。

质粒和基因组集成图。使用Piggybac转座酶将多GRNA储皮载体纳入基因组DNA。用Blasticidin选择整合体。
多GRNA Piggybac载体在Piggyba转座酶的帮助下掺入基因组DNA中。图片来自Hazelbaker等人,2020年

实验室通过抑制和激活TCF4的表达,同时监测转录本和蛋白水平来测试该系统。质粒的多路复用Piggybac.gRNA交付和一体化DCAS9-Krab.DCAS9-VPR.Addgene可发现靶向质粒。

检查这些质粒piggyBac gRNA传递和全合一dCas9靶向质粒!

Hazelbaker等人,《科学报告》,2020。https://doi.org/10.1038/s41598-020-57500-1


CRISPR角

经过德赢在线

以下是近期CRISPR质粒的一些亮点。要找到Addgene提供的所有CRISPR质粒,请访问我们的CRISPR质粒和资源页面

  • PAC-MAN(人类细胞中预防性抗病毒CRISPR)是一种基于CRISPR-Cas13的抗病毒方法降解SARS-CoV-2序列和甲型流感活病毒的RNA。它被证明在人类肺上皮细胞中起作用。
  • 用于植物的MoClo CRISPR/Cas工具包包括95个质粒,包括CRISPR/Cas核酸酶、碱基编辑器、gRNA骨干和在单子叶和双子叶中表达的启动子。
  • CRISPR RNP电穿孔和AAV供体感染(CRISPR-READI)可以使用基因组工程HDR捐赠者的长度为4.9 kb
  • 一个新的双deaminase基础编辑器使同时的腺嘌呤和胞嘧啶编辑能够。
  • 合成生物学使用的新工具克里普利控制基因表达。这包括基于crispri的合成振荡器、双稳态网络、条带图案形成的非相干前馈环路。

来自病毒服务的新增功能

经过ina ersing.

我们定期从我们的质粒收集中添加新的病毒分株以提供现成的病毒预备。以下是最近几个月的一些新的病毒准备:

  • GPCR激活的去甲肾上腺素(GRABNE)传感器允许对去甲肾上腺素进行敏感和高时空测量。这些去甲肾上腺素传感器包括GRAB_NE1h(高亲和性)和GRAB_NE1m(中亲和性),以及GRAB_NEmut作为阴性对照。
  • 黄色荧光蛋白钙传感器,钙指示剂jGCaMP7的变体,为激发波长超过1,000纳米,并使红色荧光蛋白钙传感器双色成像。这些新的钙传感器包括syn-jYCaMP1s(慢变体)、依赖于crea的syn-FLEX-jYCaMP1s和轴突靶向的syn-FLEX-axon-jYCaMP1s。
  • 新血清型PHP中依赖crep的EYFP AAV。V1显示出高效的脑泡细胞转导。
  • 新的血清型Cre-dependent Flpo重组酶PEF1A-DIO-FLPO-WPRE-HGHPA,现在也可以在AAV5和AAVRG中获得。
  • 新的控制,生物传感器,化学遗传和光遗传AAVForebrain Gaba-Ergic Interneurons中的表达。这些包括MDLX-GFP,HDLX-Flex-GFP,HDLX-Flex-Dtomato,MDLX-GCAMP6F,HDLX-GIDReadd-Dtomato和MDLX-CHR2-MCHerry。


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