热质粒：基于FRET的生物传感器

Oliver Gresbeck.Max Planck神经生物学研究所一直致力于自领域的开始以来的遗传编码的钙和其他小分子的指标。这些工程传感器旨在取代自20世纪80年代以来一直在使用的合成钙染料。

“合成染料是该领域的标准，但有一个问题：如何将其进入感兴趣的细胞，”格里斯巴克说。因为它们是化学化合物，它们必须施加或注射，并且它们并不总是最终需要他们去的地方。

Griesbeck在努力理解分子和蜂窝水平事件和行为之间的联系的努力中，通过特别兴趣监测活神经元的活动和生物化学。这是他认为“神经科学最大的挑战之一”是个问题。

热质粒：抽搐传感器

Griesbeck最近对该领域的贡献是一系列荧光共振能量转移（荧光）基础的钙生物传感器。也许最值得注意的是抽搐钙传感器，可在Addgene上使用，可用于比率体内成像。Griesebeck解释说，虽然这些抽搐传感器总是光明的，但它们在钙的存在下从“OFF”转移到“ON”时改变颜色。可以使用市售的分束器分离器在显微镜下观察到这种颜色变化。除了成像神经元之外，Gresbeck还增加了这种颜色变化具有观察在移动的细胞内发生的事件，例如T淋巴细胞。

Gresbeck和他的同事通过分离钙结合蛋白质，肌钙蛋白C（TNC），从肌肉细胞中开始。它们鉴定了一种对钙粘合和开发的高亲和力的蟾鱼TNC变体蛋白质的一种形式，其具有尽可能少的钙结合位点，以增加敏感性。

如同报道自然方法，通过在细菌中的大规模功能屏幕中测试各种接头配置，优化了这些抽搐传感器变体的FRET变化。然后通过大鼠海马神经元培养物中的次筛来改进传感器变体。优化的抽搐传感器允许研究人员看到神经元的滋补作用潜在烧制，也可以看到T淋巴细胞的高分辨率功能跟踪一种用于神经科学和免疫学的多功能工具。

不要害羞：初学者的比例成像

Griesbeck说他的钙指示剂可以用于老鼠，果蝇那C.秀丽隐杆线，和斑马鱼 - 基本上所有的标准生物都可以获得广泛的遗传工具。虽然他认识到一些初学者可能会避免比率成像，但他建议他们给它拍摄。

“初学者有时认为这是复杂的，但实际上它非常好，”他说。“它为您提供了比基于强度的读数更多的信息。”

Griesbeck还指出了他和他的同事的方法现在可以优化敏感性，现在可以应用于数十个其他出版的基于FRET的传感器。例如，他的团队现在将其应用于他们开发的指标和发表于2010年用于在活细胞中可视化转录因子阵营响应元素结合蛋白（CREB）。

“现在我们正在制作这个真的很好，”格里斯巴克说。“我们知道CREB非常重要，但它在哪里非常重要，何时？不知道。“

过渡金属

Maarten Merkx.Technische Universiteit Eindhoven在基于FRET的传感器蛋白质具有类似的兴趣，特别是对于过渡金属离子的细胞内成像，例如锌，铜和铁。

“这些是必不可少的金属离子，但它们也是有毒的，”Merkx解释说。需要新工具来衡量它们。

Merkx说，W原则上，采用用于监测钙的FRET传感器，与锌相对于锌，应该需要简单地交换绑定域，在实践中，优化传感器涉及大量的试验和错误。过渡金属也存在挑战，因为它们在比钙的浓度远低得多的细胞中发现，需要更大的灵敏度。

他和他的同事提出了一个解决方案：他们设计了自相关联的荧光域，其关联在存在配体存在下破坏（它们在一个状态下粘在一起，而不是另一个状态）。

“制作一个具有大动态范围的褶皱传感器是非常强大的方式，”他说。Merkx最近将此“诀窍”应用于发展额外的颜色变种。这导致建设Redcalwy-1，一个红移烦恼传感器对于使用Morange2和MCHERRY的变体作为供体和受体结构域的锌。他说，这些新颜色现在可以实现观察不同分子像锌和钙之间的相互作用。

最终，Merkx表示希望他人会发现他的工具有用，包括他的锌传感器和他的遗传编码的镁传感器，首先。

“我希望通过存放在addgene中，人们将开始使用它们，”Merkx说。“对我们来说，它是成功的主要措施之一-无论我们是否真的开发了一些有用的东西[足够]其他人开始使用它。对我们来说，这就像一个测试。“

参考

• Thestrup等。神经元和T淋巴细胞体内成像功能优化的比率钙传感器。NAT方法。2014年1月5日DOI：10.1038 / nmeth.2773。（PubMed.）
  
  
• Friedrich等人。在活细胞中成像CREB激活。J Biol Chem。2010年7月23日; 285（30）：23285-95。DOI：10.1074 / JBC.M110.124545。（PubMed.）
  
  
• 林登堡等人。使用自关联荧光域的鲁棒红色褶皱传感器。ACS Chem Biol。2013年10月18日; 8（10）：2133-9。DOI：10.1021 / CB400427B。EPUB 2013 8月30日（PubMed.）
  
  
• 林登堡等人。Magfreet：第一个遗传编码的荧光Mg（2+）传感器。Plos一个。2013年12月2日; 8（12）：E82009。DOI：10.1371 / journal.pone.0082009。（PubMed.）

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