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人体全基因组SGRNA ibar图书馆
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| 图1：使用SGRNA的CRISPR汇总筛选中的初始步骤伊巴拉。图片来自zhu等。，2019年。 |
分析师Wensheng魏的实验室在北京大学开发了一种新的CRISPR筛选方法，它利用其环路区域中与内部条形码（IBAR）的导向RNA。用SGRNA感染细胞后伊巴拉含慢病毒载体的文库可用于下一代测序。vwin668
为了避免高的假阳性率发现率，传统CRISPR筛选在构建细胞库时需要低感染数(multiplicity of infection, MOI)，以确保大多数细胞接收一个gRNA。即使在高感染多样性的情况下，iBAR方法也能获得高质量的数据，因为这种设置允许对每个grna进行实验复制。他们的想法是给每个gRNA分配四种不同的条形码，并将这些条形码嵌入gRNA序列中。通过计数gRNA及其iBAR序列，可以在同一实验中多次追踪每个gRNA的表现。自从sgRNA伊巴拉图书馆涵盖了每种注释的人类基因，它能够用高MOI实现基因组筛选，这是有益于少量细胞和体内设置。
Zhu等人。，基因组生物学，2019. PubMedPMID：30678704。
利用重组酶竞争进行稀疏细胞标记
通过重组酶竞争（SPARC）稀疏预测活性是一种全遗传工具，用于标记遗传定义的细胞的一部分。通过在人口中标记更少的单元格，更容易可视化单个/非重叠单元格。到目前为止，这样做的工具是劳动密集型的，并且需要使用诸如注射的AAV精确滴定或热震动生物体的操纵。
SPARC系统使用竞争性重组位点来选择性地除去效应/报告基因的上游止动盒。在去除止动盒的细胞中，表达效应器。通过将构建体中的一个重组位点截断到不同的长度，标记的细胞的密度可以改变为致密（标记为45％的细胞），中间体（12％）和稀疏（4％）水平。
SPARC是一个多功能系统，可以用于许多细胞类型和生物体，包括果蝇，鱼，和老鼠，通过替换效应基因在你正在研究的细胞。阅读我们的SPARC博客更多细节。
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图2：胆汁指示剂的致密（c），中间体（d）和稀疏（e）标记，Gcamp6f，在果蝇视神经叶中。图片来自Isaacman-Beck等，2019年。 |
Isaacman-Beck等，Biorxiv 2019。https://doi.org/10.1101/788679
不稳定的GFP报告酵母钙调磷酸酶活性
钙调神经磷酸酶是一种蛋白磷酸酶，它对细胞内钙水平上升作出反应。当钙含量2+钙调神经磷酸酶在细胞中含量高时，钙调神经磷酸酶去磷酸化蛋白质CZI, CZI反过来与钙调神经磷酸酶依赖的反应元件(cres)结合，驱动基因表达。因为钙调神经磷酸酶是致病真菌毒性所必需的，所以它是一个很有吸引力的药物靶点。钙调神经磷酸酶报告基因允许科学家测量钙调神经磷酸酶的动态，并可以作为一个药物筛选平台，以确定新的抗真菌药物靶向钙调神经磷酸酶。
目前的钙碱基因记者基于细菌βGAL测定，并且不适合高通量筛选，钙碱动力学测量或监测在活的有机体内。克服这些技术问题，SabrinaBüttner的实验室设计了一种钙调神经磷酸酶转录报告基因，由一个快速降解的不稳定的GFP变体融合到一个4X cre重复序列。除了表明该载体适用于流式细胞术和荧光显微镜，他们还表明该方法与使用丙啶碘(PI)的死细胞染色兼容，允许在应激或衰老细胞群中钙调神经磷酸酶活性的测量。
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| 图3:野生型(上面的图)和细胞内Ca2+含量高的细胞(下面的图)配备了不稳定的GFP钙调磷酸酶报告蛋白(蓝色)，PI染色(粉色)显示细胞死亡。图片来自Diessl等人。，2020年。 |
Diessl等人。，微生物细胞，2020。https://dx.doi.org/10.15698%2FMIC2020.04.713
作为DNA染色染料截断的故事荧光蛋白融合
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| 图4:双链DNA与tTALE-FP结合，荧光蛋白荧光绿色。图片来自Shin等人，2019年。 |
寻找替代嵌入荧光染料的替代DNA蛋白质相互作用研究？Kyubong Jo的实验室用Ttale产生荧光蛋白融合到“染色”DNA。故事蛋白可以结合特异性DNA序列，使连接的荧光蛋白与DNA带来。它们产生质粒纯化Ttale-EGFP和Ttale-MCHERRY。
与插入荧光染料可引起DNA的光致断裂和结构变形相比，这些探针是可逆的，不引起结构变形或光致损伤。这些融合也可以在高盐条件下发挥作用-高达100mm NaCl。在40mm ~ 100mm NaCl范围内，与GC-rich区域相比，这些tTALE-FPs对AT-rich区域具有更高的DNA结合亲和力，但在1x TE缓冲液中染色均匀。该实验室还将tTALE-FP用于单分子荧光分析，实时监测单分子的限制性内切酶消化。
Shin等人，科学。众议员2019。https://doi.org/10.1038/s41598-019-53722-0
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