如何设计适合CRISPR基因组编辑的gRNA

客人的博客

最初发布于2017年5月3日,最后更新于2020年9月24日

本文由客座博主、Addgene咨询委员会成员、Broad研究所科学家John Doench撰写。

CRISPR技术使得更容易于工程师特异性DNA编辑并且执行功能屏幕以识别涉及感兴趣表型所涉及的基因。此博客文章将讨论这些方法之间的差异,并提供有关如何最好地设计GRNA的更新。您还可以在Addgene的下一次实验中找到验证的GRNA验证了gRNA序列数据表。关于这些主题的更详细的讨论可以在最近的两篇评论文章(Doench等人,2017,汉娜等人,2020年)及参考资料。

说明CAS蛋白结合GRNA和靶DNA的漫画。CAS蛋白标记为Casm(Onster),看起来像饼干怪物。它有一个引用泡沫,称“我爱Gtacagcctg”。
NOM NOM。我爱grnas!玛雅·克朗特曼漫画。

开始CRISPR实验前要注意的重要事项

锤子,竖锯和扳手都是伟大的工具,但当然,你使用哪一个取决于你想要做的事情 - 他们之间没有“最好的”工具。虽然这似乎是显而易见的,但重要的是要记住,当使用CRISPR技术设计GRNA时,同样是真的 - “最好的”GRNA在您想要做的事情上取决于糟糕的地段:基因敲除,特定的基础编辑或调制基因表达。

序列v位置位置和序列是设计grna的重要考虑。对于indels来说,目标基因的哪个位置并不重要,重要的是你的gRNA序列被设计成高度活跃并减少靶点。对于CRISPRa和CRISPRi,这些考虑是大致相同的重要性(目标应该在TSS附近,但你可以少担心序列的最优性,因为你通常有更少的序列可以选择)。最后,对于HDR来说,定位更为重要,因为你的目标必须在拟编辑的30 nt以内,这意味着从序列偏好中选择的grna非常少,必须在很大程度上被忽略。

锤:基因敲除的NHEJ


使用CRISPR创建indels
基因敲除CRISPR技术通常是通过cas9介导的dsDNA断裂来完成的:在剪切之后,非同源端连接的错误倾向(NHEJ)通常导致诱导的产生,从而产生破坏轨迹的蛋白质编码能力的架构。使用时链球菌Cas9(SpCas9),潜在的靶位点都是[5 ' -20nt-NGG]和[5 ' -CCN-20nt],因为它对DNA编码链和非编码链同样有效。根据经验,我们避免蛋白质N '端附近编码氨基酸的目标位点,以减少细胞使用注释起始密码子下游的替代ATG的能力。同样地,我们避免编码靠近蛋白质C '端氨基酸的目标位点,以最大限度地创造非功能等位基因的机会。对于一个1kb的基因,每8个核苷酸中有1个可能的靶位点,将gRNAs限制在5 - 65%的蛋白质编码区,仍然会产生数十个gRNAs可供选择。在如此多的可能性中,选择一个最优序列的gRNA是最重要的。

拼图:HDR编辑,基础编辑和基本编辑

使用CRISPR进行基因组编辑

对于特定的编辑,例如插入荧光标签或者引入特定突变,一般依赖于同源性定向修复(HDR)将新信息整合到DNA中。这也需要一个外源性DNA模板。然而,HDR是一个非常低效率的过程,通常涉及单细胞克隆和随后筛选成功编辑的需要。这是一个非常耗时的过程,不应该轻易进行!事实上,真正实现金本位并不需要一个但是循环的单细胞克隆 - 作为一个控制,一个人应该将编辑恢复到原来,以证明表型真的是由于预期的编辑而不是与单个细胞克隆一起出现的一些乘客变体(虽然这是很少完成)。

针对HDR定位DSDNA断裂时,目标网站的选择远受编辑所需地点的约束;当切割位置在距离近端>30nt时,效率显著降低修复模板(Yang等,2013)。这意味着,对于基因编辑,通常存在潜在的GRNA。虽然SPCAS9,具有NGG的PAM偏好,仍是最广泛使用的CAS酶,SACAS9,NMECAS9,CAS12A酶的开发及其工程变体提供额外的PAM选项可以极大地扩展gRNA选项

两种更新的技术提供了HDR之外的另一种引入编辑的方法。同样的位置限制对于所谓的基本编辑Cas9,在没有dsDNA断裂(雷斯等人。,2018年)。对于C>T和A>G碱基编辑器,预期的编辑必须位于相对于PAM的5 - 10 nt窗口中,如果窗口中有另一个目标C或A,则可以进行旁观者编辑。另一种技术,'编辑(综述Anzalone等人,2020年)。并不局限于单核苷酸转换,但仍然需要附近的PAM,尽管这仍是该技术的早期阶段,用户可能需要优化许多参数来生成所需的编辑。

扳手:基因激活和抑制的CRISPRa和CRISPRi

最后,在转录水平上调节基因表达Crispra.(激活),克里普利(抑制)技术 - 核酸酶死Cas9(DCAS9)涉及靶基因的启动子附近。在这里,目标窗口不像CRISPR切割一样广泛地宽。对于Crispra来说,它最有效地瞄准转录开始站点(TSS)上游的〜100nt窗口,而对于CRISPRI,TSS下游的〜100nt窗口提供了最多的活动。因此,给定的基因仅具有十几个或如此的GNA可从最佳位置中选择。在有关TSS的确切位置,还有良好的信息也很重要。不同的数据库以不同的方式注释TSS,并且已经显示了怪人依赖于笼式SEQ直接捕获mRNA帽的数据库提供了最准确的映射(Radzisheuskaya等,2016)。在这种情况下,位置和序列在设计方面大致相同 - 如果目标窗口更窄,则优化序列将很少,但是,可以选择更少的GRNA,因此可以选择较少的GRNA,因此最佳序列可能不可用。

预测gRNA功效

我们和其他人已经研究了利用序列和其他特征来提名可能活跃的gRNAs的能力,不仅是对SpCas9,而且对其他一些Cas酶。这似乎是没有统一的评分系统的情况下选择一个gRNA,作为生产指导的方法(体外转录合成,或慢病毒交付)会影响预测评分的准确性,以及动态方面的目标(如可访问性由于染色质状态)。没有任何计算预测是完美的,但这可以减少一个人需要在实验室中测试的向导的数量。

重要的是,对于任何有意义的修改,以单个gRNA的活性为基础做出结论都是不明智的,因此在使用敲除或转录调节方法时,应尽可能检查一个基因中gRNA的多样性。

避免非目标效应

不中

GRNA的偏离目标活动对于考虑很重要。While the basic landscape of mismatches that can nevertheless still lead to activity has been established, and can be used to identify sites that are likely to give rise to an off-target effect, there’s not enough data to fully predict which sites will and will not show appreciable levels of modification. Whole-genome sequencing of cells modified by CRISPR indicates that the consequences of off-target activity, at least for the experimental conditions used,没有可检测到的突变(Veres等,2014)。当使用单细胞克隆时,作者指出,“克隆异质性可以代表生成真正的中生细胞系的障碍而不是核酸酶介导的偏离目标效应。”此外,使用基因组文库数百个遗传筛网的大规模数据集在靶向相同基因的不同序列之间显示出高的一致性,这表明这一点在这些试验中,脱靶效应并没有压倒真信号(Dempster等,2019)。同样,实验策略是明确的:对于任何感兴趣的基因,人们应该要求多个不同序列的gRNAs产生相同的表型,从而得出表型是由于靶效应的结论。

结论

实验中gRNAs的选择需要平衡最大化靶上活性和最小化靶外活性,这听起来很明显,但往往需要做出艰难的决定。例如,是使用活性较低的gRNA靶向基因组中真正独特的位点,还是使用活性较高的gRNA在基因组中没有已知功能的区域中附加一个靶点?对于建立用于长期研究的稳定的细胞模型,前者可能是更好的选择。然而,对于一个进行基因筛选的全基因组文库来说,由后者组成的文库可能更有效,只要在解释结果时小心谨慎,需要多个针对某个基因的序列来得分,以便称该基因为命中。

对于功能基因组学来说,这是一个激动人心的时刻,探索基因功能的工具越来越多。最好的工具只取决于使用它们的人,而正确使用CRISPR技术总是依赖于仔细的实验设计、执行和分析。

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非常感谢我们的客座博主John Doench!

CRISPR专家John DoenchJohn Doench是研发总监遗传扰动平台Broad研究所并与许多addGEIES合作,帮助改善我们的理解,策划和解释CRISPR资源。他真的很喜欢小的rna。

参考文献

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