使用CRISPR-TRASSPOSONS整合:细菌基因组工程

由Guest Blogger.

这篇帖子由Guest Blogger,Leo Vo是哥伦比亚大学医疗中心的斯特恩伯格实验室博士候选人的贡献。

DNA转座子是普遍存在的遗传元件,能够在基因组内和基因组之间传播,并已被广泛应用于各种各样的应用——作为基因研究的诱变工具(例如使用水手),作为一种标记下一代测序管道的方法(例如使用Tn5),以及作为人体治疗的敲入工具(例如使用睡美人)。尽管DNA转座子具有多种用途,但它们有限的可编程性阻碍了它们的发展:根据所涉及的转座子,它们可以随机插入,也可以插入固定的基因组靶点。

这个障碍最近被Sternberg和Zhang实验室发现的crispr转座子所超越(Peters et al., 2017;Klompe等人,2019;Strecker等人,2019年),它指导rna引导的转位。通过结合转座子的DNA整合能力和CRISPR-Cas的目标可编程性,这些系统代表了高效和可编程将大型DNA插入细菌基因组的下一代工具。这种新能力被Sternberg小组命名为INTEGRATE(插入转座因子的引导rna辅助靶向),和被Zhang小组命名为CAST (crispr相关转座酶)。

CRISPR-transposons机制

crispr转座子系统是由斯特恩伯格实验室来源于霍乱弧菌(霍乱弧菌整合-以后VchINT)和编码一个I-F型CRISPR-Cas系统。rna引导DNA整合所需的四种主要成分(图1A,顶部):

  1. 一种CRISPR RNA (crRNA),由指定靶点的32 nt间隔序列组成。
  2. 四种蛋白(TniQ, Cas8, Cas7, Cas6)与crRNA一起形成QCascade dna靶向模块。
  3. 三种转座酶蛋白(TnsA, TnsB, TnsC)。
  4. 供体DNA(又称迷你转座子),包含目标DNA,其两侧为~50- 150bp的转座子端序列(R和L端)。

左:I-F型系统和V-K型系统的组件。右图:QCascade复合物靶向靶点,而转座酶复合物带来供体DNA。

图1:(A)每种类型的crispr -转座子系统所涉及的组件。(B) I-F型integration中rna引导转位的机制。

与II型系统(如CRISPR-Cas9)使用的单蛋白效应器相比,I型CRISPR-Cas系统的特点是需要多个Cas蛋白来形成级联靶向复合物。然而,与常规的I型CRISPR-Cas系统不同,VchINT的级联并不招募其他的核酸酶(如Cas3)或有自己的核酸酶活性。相反,它与转位蛋白TniQ形成一种新的协同复合体用于靶向(Halpin-Healy et al., 2020)。基因组目标需要上游2bp的PAM序列进行QCascade识别;尽管5 ' -CC-3 '是VchINT最好的PAMs之一,许多其他PAMs也被系统有效地识别。

通过CRRNA引导,Qcascade复合物使用RNA-DNA碱基配对来调查基因组并结合靶DNA序列。另外,TNSABC与迷你转座子形成转座酶络合物,从供体分子中屈服,并将其在由Qcascade结合的基因组靶位点下游插入〜50bp(图1B)。该过程还创造了5-BP目标网站重复(TSD),是TN7家族的标志特征。迷你转座子的插入可以以两种不同的取向发生,但是朝向T-RL强烈偏向,其中R末端近似于靶位点(Klompe等,2019,vo等,2020)。

V-K型crispr -转座子系统的功能与I-F型非常相似,但使用了一个Cas12k蛋白而不是三个Cas蛋白(图1A,底部),并且只需要两个转座酶蛋白(TnsB和C)。尽管rna引导的DNA整合所需的组件较少,V-K型系统经常产生偏离目标的DNA插入和中间结构,称为共整合(Vo et al., 2020;Strecker等人,2020年)。

细菌基因组工程的CRISPR-转座

在Sternberg小组的VchINT的最初报告中,使用了三个独立的质粒和多个启动子来表达VchINT的必要成分大肠杆菌(Klompe等,2019)。最近,实验室引入了一种流线型表达式方法(图2A),涉及双质粒或单质粒系统(Vo et al., 2020)。在双质粒系统中,效应质粒(pEffector)在同一个启动子下表达所有七个必需的基因和CRISPR RNA,而供体质粒(pDonor)编码小转座子。pEffector和pDonor也可以结合在单质粒integration (pSPIN)中,这为更小的载体提供了简单的转换,并且能够在整合后很容易治愈质粒的细胞。

左:vChint表达系统是一种或两种质粒系统,可带来CRISPR阵列,CRISPR蛋白,转座酶蛋白和供体货物。右:在30℃下,迷你转座在37℃下的迷你转座子的含量效率保持〜100%,迷你转置尺寸增加,集成效率降低。
图2:(A)简化的VchINT表达结构。(B) VchINT在两种不同培养温度下实现了高集成效率。数据改编自Vo等人,2020年。

大肠杆菌,新的流线型VchINT系统可以催化大小可达10 kb的迷你转座子的插入,效率为90-100%(图2B), >对靶点的特异性为99%。此外,通过并行表达多个crrna(图3),可以实现多路插入到多个不同靶点(Vo et al., 2020)。VchINT也被证明在各种革兰氏阴性细菌宿主中具有活性,包括在混合群落中以及以前没有培养或分离的物种中(Rubin et al., 2020)。

使用含有多间隔CRISPR阵列的单个质粒可以实现多路插入。它对不同的gRNAs进行编码,这些gRNAs定位于基因组的不同位置。
图3:使用含有多间隔CRISPR阵列的单个质粒的I-F integration多路插入。

工作流程和技术考虑

在细菌基因组中插入诉霍乱集成系统遵循简单的工作流程:

  1. 将克隆间隔物克隆到CRISPR阵列中
  2. 克隆想要的DNA货物到迷你转座子
  3. 将质粒转化为细胞和平板过夜
  4. 通过表型或PCR/测序筛选菌落

在这里找到整合质粒!

虽然CRISPR-TRANSPOSONS功能强大而且使用简单,但用户应该留意一些重要的细节。对于在转座期间特异性识别的转座子,遗传尸体必须侧翼而不是末端 - 因此,与涉及同源重组的方法,目前不可难步的插入。另外,这些转座子还表现出称为目标免疫的东西,由此具有相同转座子的多个近侧插入表现出降低的效率(Vo等,2020)。

CRISPR工具箱中的CRISPR转座子

rna引导的转座子是增长中的令人兴奋的新补充CRISPR工具箱用于细菌基因组工程,以及更成熟的工具,如cas9 -重组,CRISPRa/i和碱基编辑。crispr转座子利用不同生物元素之间的独特结合,擅长在一个或多个期望的基因组位点上,即使是非常大的遗传货物,进行可编程插入。这些系统的许多应用已经被证明,从大规模基因组插入和/或缺失,到多路基因敲除(Vo等,2020),到代谢盒的多拷贝基因组整合(Zhang等,2020);然而,crispr转座子所带来的技术潜力尚未完全实现。


狮子座Vo头像非常感谢我们的客座博主Leo Vo!

Leo Vo目前是哥伦比亚大学医学中心斯特恩伯格实验室的博士候选人。他目前研究CRISPR生物学和CRISPR基因组工程技术。在推特@Vopinator上留言或关注他。

参考:

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Klompe SE, Vo PLH, Halpin-Healy TS, Sternberg SH(2019)转座子编码的CRISPR-Cas系统直接rna引导的DNA整合。自然571:219 - 225。https://doi.org/10.1038/s41586-019-1323-z

Peters Je,Makarova Ks,Shmakov S,Koonin Ev(2017)通过TN7的超容器招募CRISPR-CAS系统。Proc Natl Acad SCI USA 114:E7358-E7366。https://doi.org/10.1073/pnas.1709035114.

He C, Xu M, Zhou Z, Tang K, Owens TK, Krishnappa N, Sachdeva R, Deutschbauer AM, Banfield JF, Doudna JA(2020)微生物群落中细菌基因组的靶向编辑。bioRxivhttps://www.biorxiv.org/20.07.17.209189v2.

Strecker J,Ladha A,Gardner Z,Schmid-Burgk JL,Makarova Ks,Koonin EV,Zhang F(2019)RNA引导的DNA插入CRISPR相关的转座酶。科学365:48-53。https://doi.org/10.1126/science.aax9181

Strecker J, Ladha A, Makarova KS, Koonin EV, Zhang F (2020) Response to Comment with RNA-guided DNA插入与crispr相关的转座。科学368:eabb2920。https://doi.org/10.1126/science.abb2920

Vo PLH, Ronda C, Klompe SE, Chen EE, Acree C, Wang hhh, Sternberg SH (2020) CRISPR rna引导的整合酶用于高效多路细菌基因组工程。生物科技Nat》。https://doi.org/10.1038/s41587-020-00745.

张Y,太阳x,王q,徐继,董开,杨s,杨j,张z,钱y,陈j,张j,刘y,陶河,江y,杨j,杨s(2020)使用CRISPR相关转座酶的多拷贝染色体整合。ACS Synth Biol 9:1998-2008。https://doi.org/10.1021/acssynbio.0c00073

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