vwin德赢娱乐平台荧光蛋白101:备写简介

作者:jason niehaus.

想象力能够确定两个蛋白质是否在彼此的10纳米内,或者测量蜘蛛丝的螺旋结构中的张力,或突触中蛋白质的活性。哪种工具使我们能够测量这些属性,以及令人着迷的实验可以进一步推动这些工具?所有这些东西都可以使用FRET完成!继续阅读以了解有关此惊人的成像技术的更多信息,并进一步了解在您的实验中使用FRET的提示

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你说的这个烦恼是什么?

FÖrster.R.骗子E.nergyT.转移(FRET)最初由Theodor Förster在1948年描述为一种更常见的荧光发射的变化。荧光荧光分子的广泛应用包括vwin德赢娱乐平台,导致替代的首字母缩略词F思韵R.骗子E.nergyT.ransfer。与典型的激发荧光团的典型激发和发射不同,FRET涉及从激发的供体荧光团到受体荧光团的非辐射能量转移(即,没有发射的光子)。FRET中的典型步骤是:

1。通过吸收光子的供体荧光激发

2.从兴奋的供体直接到受体荧光团的能量转移 - 将其视为虚拟光子

3.通过向受体具有波长的光子发射光子,将受体荧光团的放松回到其地位

FRET光谱重叠为了使FRET发生,必须满足若干约束。施主和受体荧光团必须兼容,使得供体荧光团的发射光谱与受体荧光团的激发光谱重叠。否则从捐赠者转移的能量将无法激发受体。除了足够的光谱重叠之外,荧光团必须位于彼此的1-10nm内,并通过偶极偶极相互作用适当地定向以进行能量转移。

可以针对给定的供体对 - 受体对测量尺寸的效率,并且FRET效率的变化与FRET对的距离和/或取向的变化相关。由于许多生物过程发生在典型的FRET范围内,因此使用FRET效率来推断荧光团之间的相互作用,并用作小尺寸标尺,以测量传统光学显微镜的微小微小的距离。

不要担心 - 使用这些彩信!

由于荧光团对的选择是FRET实验的一个关键考虑因素,考虑到荧光蛋白的种类繁多,这种可能性似乎是压倒性的。vwin德赢娱乐平台幸运的是,一些优秀的评论整理了来自不同论文的数据,使这个决定更容易。

1。Müller,Sara M.等人。“通过监测活植物细胞中的敏化排放来定量Förster共振能量转移。”(2013)。PubMed.PMID:24194740。pmed中央PMCID:PMC3810607.

2。Bajar,Bryce T.等人。“荧光蛋白质Fret对的指南。”传感器16.9(2016):1488。PubMedPMID: 27649177。pmed中央PMCID:PMC5038762

乔治亚伯拉罕,鲍宾。等等。“基于荧光蛋白的FRET对具有改进的荧光寿命测量的动态范围。”普罗斯一体10.8 (2015): e0134436。PubMed.PMID:26237400。pmed中央PMCID:PMC4523203.

分子间褶皱生物传感器我们的含有这些荧光蛋白的许多空载体可在我们的vwin德赢娱乐平台FRET资源页面并且可用于创造具有感兴趣基因的融合。这些质粒对构建分子间荧光探针最有用,其中供体和受体荧光团与两个单独的蛋白质融合。(相反,分子内的荧光探针在相同蛋白质上含有供体和受体荧光团,并且当过程影响探针的构象时是有用的。更多关于这些生物传感器。使用分子间FRET探针的实验通常用于通过测量FRET效率的变化来研究蛋白质 - 蛋白质相互作用,从中可以推断出两种蛋白质的接近的结论。

分子间褶皱可以通过实验难以实现,因为受体对供体融合的比率随转染效率而变化,并且任何未配对的荧光蛋白都可以为测量产生额外的噪音。vwin德赢娱乐平台如果供体和受体蛋白的距离或取向不是最佳的,即使两种蛋白质形成复合物,也可能不会发生或被检测到任何情况。

分子内褶皱生物传感器

帮助对实验设置进行故障排除,作为次优或无法侦测的潜在误差源,表征好FRET参考标准可用于验证FRET测量并用作一种肯定控制。在不利的施主 - 受体定向限制FRET效率,循环置换(Baird等人。,1999年)荧光蛋白(即,在不改变蛋白质中的氨基酸的顺序的情况下重新排列的开始和结束位置)可能能够促进效率。

在构建自己的FRET探针之前,尝试搜索PubMed.获取描述您正在寻找的FRET工具的文章,并查看我们的策划生物传感器列表而且,由于另一个实验室可能已经创建了所需的传感器。设计用于测量特定小型生物分子或基因活性的褶皱生物传感器通常是分子内探针,因为供体和受体之间的接头序列对环境变化的变化来敏感,这改变了压力效率。检测与分子间探针的某些细胞变化通常是不切实际的(对于不是蛋白质的生物分子)或者会扰乱你想要测量的内源状态(过度表达在转染后过度表达基因或蛋白质)。

担心的未来

第一个遗传编码的FRET Biosensor,Cameleon(Miyawaki等。,1997年),旨在测量细胞内钙并于1997年发布。从那时起,探针设计的许多进展,荧光蛋白和显微镜设备都提高了实验室回答有关细胞过程复杂问题的能力。vwin德赢娱乐平台目前,FRET实验可以探测蛋白质 - 蛋白质相互作用,测量小分子的浓度或活性,检测细胞过程和信号级联,量化机械张力(分子“弹簧”)(Meng等人,2008年),并监测神经元活动(电压传感器),以命名几个。

在Addgene的生物传感器页面上找到许多基于FRET的生物传感器

最近的创新已经证明了使用单分子FRET用于活细胞中的成像生物分子(verarsic和Kapanidis 2015),这可能导致在活体动物中监测这些过程(Hirata和Kiyokawa 2016)和分子张力显微镜(MTM),其可能监测物理应力甚至施加力(Gayrard和Borghi 2016)到选定的蛋白质。克服电流限制以同时使用多个FRET生物传感器的使用将进一步增加蜂窝过程可获得的相关信息量。预计FRET实验将继续促进我们对疾病的理解,甚至有助于药物发现。


参考文献

1. Baird,Geoffrey S.等人。“绿色荧光蛋白内的圆形排列和受体插入。”vwin德赢娱乐平台国家科学院的诉讼程序96.20(1999):11241-11246。PubMed.PMID:10500161。pmed中央PMCID:PMC18018.

2。Miyawaki,atsushi等。“基于绿色荧光蛋白和钙调蛋白的CA2 +的荧光指示剂。”vwin德赢娱乐平台自然388.6645(1997):882。PubMedPMID:9278050

3.孟,凡杰,等。“荧光能量转移基机械应力传感器,用于特定蛋白原位。”FEBS Journal.275.12(2008):3072-3087。PubMed.PMID:18479457。pmed中央PMCID:PMC2396198

4.Assarsic,Marko和Kapanidis,Achillefs N.“以丛林为统治者:单分子FRET,用于了解活细胞中的生物分子结构和动态。”结构生物学目前的意见34(2015): 52-59。PubMed.PMID:26295172

5。HiRata,Eishu和Kiyokawa,Etsuko。“单分子FRET生物传感器和嗜睡术微观显微镜的未来透视。”生物物理学杂志111.6(2016):1103-1111。PubMed.PMID:27475975.

6。Gayrard, Charlène,和Borghi, Nicolas。“基于freet的分子张力显微镜。”方法94(2016):33-42。PubMed.PMID:26210398

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