Lambda红:基于同源重组的基因工程技术

由Beth Kenkel.

限制酶克隆是主的分子克隆;然而,其最大的局限性之一是序列修饰只能在限制性内切酶的剪切位点上进行。lambda red系统是一种基于同源重组的可用于克隆或基因组工程的替代方法。它允许对DNA进行直接修饰大肠杆菌并独立于限制性位点。λ红色系统来自λ红噬菌体,其用作基因工程工具经常被称为重组机构 - 用于同源的​​简短重新计算nation-mediated遗传工程。它可用于制作各种修饰:插入和删除可选择和不可选择的序列,点突变或其他小型碱基对变化,以及添加蛋白质标签。它还具有修改的灵活性大肠杆菌染色体,质粒DNA或BAC DNA。

要使用lambda red重组系统来修饰你的目标DNA,你首先电穿孔一个线性供体DNA底物(要么是dsDNA,要么是ssDNA -见下)大肠杆菌表达λ红酶。然后将这些酶用靶DNA序列催化基材的同源重组。这意味着克隆发生体内,与限制酶克隆相比,在试管中发生遗传变化的限制酶克隆。供体DNA底物仅需要〜50个同源性的核苷酸与靶位点进行重组。

Lambda Red重组系统的关键部件

λ红色组件Lambda红重组系统具有三种组分(图1):1)EXO,2)β和3)Gam。所有三种都需要与DSDNA底物重新组织;然而,在用SSDNA衬底产生修改时,仅需要测试。

gam:GAM可防止内源性RecBCD和SBCCD核酸酶从消化的线性DNA引入大肠杆菌

exo.: Exo是一个5 '→3 ' dsdna依赖的外切酶。Exo将从5 '端开始降解线性的dsDNA,并产生2种可能的产物:1)部分的dsDNA双链,单链3 '外伸;2)如果dsDNA足够短,则整个互补链被降解的ssDNA。

β:β保护EXO产生的SSDNA,并促进其退火到细胞中的互补SSDNA靶标。仅使用SSDNA寡核苷酸衬底重新组织β表达。

试验大纲

Lambda Red重组过程概述以下是通用Lambda红色重组实验的简要概要(图2)。在以下部分中,将更详细地解释与传统限制酶克隆不同的关键步骤。

  1. 底物DNA的设计与生成
  2. lambda red重组基因的表达。
  3. 底物DNA的电穿孔与细菌的生长。
  4. 重组克隆的选择与确认。

底物DNA的设计与生成

无论您使用线性DSDNA或SSDNA衬底是否取决于实验的目标。DSDNA衬底最适合于大于约20个核苷酸的插入或缺失,而SSDNA底物最适合点突变或仅少数碱基对的变化。

dsDNA衬底

dsDNA插入可以通过PCR进行,引物扩增目标DNA序列,并在其侧翼与目标插入位点具有50对同源性碱基对(图2,顶部)。这些引物通常有~70个核苷酸长(20个核苷酸对目标DNA序列进行退火,50个核苷酸对目标位点两侧的区域具有同源性)。dsDNA插入的最佳应用包括:大型插入或删除,包括可选择的DNA片段,如抗生素抗性基因,以及不可选择的DNA片段,例如基因替代品标签典型的重组频率是1 / 10阳性克隆4到105群落。

Exclamation.jpg专家提示:使用高保真Taq聚合酶,具有证明能力,用于产生DSDNA重组底物以避免PCR期间引入的误差。

SSDNA底物

ssDNA底物可以通过对合成的寡核苷酸进行排序或使短PCR产物变性来生成。无论哪种方法,底物长度应该在70-100个核苷酸之间,而所需的改变位于序列的中心。因为当DNA的后随链被锁定时,lambda red的重组频率更高,所以最好确定你感兴趣的区域的复制方向,并设计一个与后随链互补的寡核苷酸。在实践中,不确定复制的方向,而设计针对两条链的寡核苷酸更容易。两个寡核苷酸中的一个会以更高的效率重组你会从经验中发现哪一条是后随链。

SSDNA底物比DSDNA更有效,重组频率在0.1%至1%之间,并且通过设计寡核苷酸可以增加至高达25-50%,避免激活甲基 - 指定的失配修复系统。MMR的工作是纠正DNA复制期间发生的DNA不匹配。有两种方法可以避免激活MMR:1)使用具有关键MMR蛋白的细菌的菌株或2)特别设计SSDNA寡核苷酸以避免MMR:

1)大肠杆菌灭活MMR:使用大肠杆菌由于无效MMR绝对是两个选项的更容易,但这些细胞容易突变,并且对其基因组有更多的意外变化。

2)设计避免MMR活化的ssDNA寡核苷酸:设计避免MMR活化的寡核苷酸有两种方法。第一种方法是在编辑位点的6个碱基对处或6个碱基对内引入C/C失配。这是一个简单的修复方法,但只能在有限的情况下使用。另一种方法是用4-5个wobble密码子的无声变化来包住想要的变化,即对相邻的4-5个密码子的第三个碱基对进行改变,改变的是核苷酸序列,而不是翻译蛋白的氨基酸序列。这些更改可以是所需更改的5 '或3 '。

表1:DS-and SS-DNA在重组中使用的概述

基质 最适合的应用程序 重组频率 特殊考虑因素
dsdna. 插入或删除> 20个核苷酸 十分之一4到105 使用高保真度的Taq聚合酶生成插入物
ssDNA 点突变或改变一些核苷酸 避免MMR激活时0.1-1%或25-50% 在摆动密码子中引入C/C不匹配或无声变化,以避免MMR激活

Lambda红重组基因的表达

有四种方式来表达lambda red重组系统:1)从具有整合缺陷噬菌体的细菌2)从质粒,3)从迷你λ或4)从lambda red噬菌体本身(这些将在下面详细讨论)。控制Red蛋白的表达对于最小化Gam表达的毒性作用和限制Red构成表达时发生的自发突变至关重要。你使用哪种重组系统取决于你想编辑的DNA类型;然而,BAC DNA可以用下面描述的任何一种方法进行修饰。

具有完整缺陷噬菌体的菌株

大量的大肠杆菌由于整合了一个缺陷的lambda红色噬菌体,存在稳定表达lambda红色重组基因的菌株。其中一种菌株是DY380,它来自于DH10B大肠杆菌压力。其他几种常用来进行重组的菌株也可以在T同性恋者夏朗(几菌株也可以在addgene中找到,但务必阅读相关论文的特定用途 - *注意事项*并非所有链接菌株都包含Lambda红色系统)。

在这些菌株中的一些,表达挂式,betgam受到内源性噬菌体启动子pL和阻遏子CI的紧密调控。为了进行重组,阻遏基因的温度敏感版本,CI857,使用。该突变抑制因子在低温(30-34˚C)下抑制重组基因的表达。将细菌移至42˚C 15分钟,抑制因子迅速被灭活,重组基因得以表达。在这之后,降低温度允许抑制因子重新自然,并再次抑制表达挂式,betgam。这种方法用于lambda red表达的一个主要优点是它不需要选择抗生素来维持重组系统的表达。该装置也可用于染色体基因的修饰。在初始编辑事件后,有缺陷的原噬菌体可以从宿主的染色体中被移除大肠杆菌通过第二个Lambda红色重组事件。或者,如果修饰的等位基因可选择,则它可以通过P1转换转移到不同的遗传背景。

质粒

表达来自a的λ红色基因质粒允许一个可移动的重组系统,但严格的表达调控需要一个成功的实验。启动子通常用于控制Red表达的有iptg诱导的lac启动子、阿拉伯糖诱导的pBAD启动子和内源性噬菌体pL启动子。选择同样表达与这些启动子相关的抑制因子(lacI, araC,cI857)限制红色系统的泄漏表达。使用质粒表达λ重组系统最适合编辑细菌染色体DNA,因为一旦产生重组克隆,它易于除去重组系统。这样做的简单方法是从具有热敏复制起源的质粒表达λ红色基因。一旦不再需要重组系统,细菌可以通过在42℃下生长它们来“固化”。

迷你λ

使用质粒和缺陷性缺陷的稳定整合之间的杂交是使用Mini-λ,一种有缺陷的非复制圆形噬菌体DNA,即当被引入细菌时,整合到基因组中。mini-λ使用内源性红色启动子pl和cI857压缩机调节表达。抗生素可用于选择阳性克隆,但由于Mini-λ稳定整合,因此不需要进行药物选择。到42℃的温度变化不仅允许激活重组所需的红色基因,而且导致表达切除酶从宿主染色体上切除小λ的基因。在此之后,迷你λ就可以像质粒一样从细菌中很容易地纯化出来。

噬菌体

表达红色系统的最后一个选择是使用一个红色噬菌体,λ.TetR,携带四环素抗性基因和λ红色阻遏物cI857。一旦引入,噬菌体是稳定的,不再需要药物选择。这种方法的一个缺点是需要产生噬菌体,这不是一种常见的分子生物学技术。然而,这种方法的一个优点是,你可以稳定地将Red系统整合到你自己感兴趣的菌株中,如果需要的话,可以使用P1转导将修饰转移到不同的背景中。这种方法最适合修饰质粒或bac,因为它可以使噬菌体稳定地整合到大肠杆菌基因组。

重组克隆的选择和确认

如果插入抗生素抗性基因,则可以首先通过抗生素抗性选择重组剂,但是应进一步测试所有克隆以确认所需改性的存在。菌落PCR在大多数情况下可用于筛选阳性克隆,限制性内切酶消化可用于筛选适当的突变质粒。点突变和其他细微的变化应经确认测序,这也是所有克隆的最佳最终确认,无论修饰的目标是什么类型的DNA大肠杆菌染色体,质粒或BAC。

Exclamation.jpg专家提示: ssDNA底物的重组率比dsDNA底物高得多,所以你应该在使用dsDNA时筛选更多的克隆。

你用过lambda红色重组系统吗?在下面分享你的建议吧!

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非常感谢我们的博客,Beth Kenkel

贝丝学会主席Beth Kenkel目前是华盛顿大学实验室医学系的研究科学家。她对科学传播和体外诊断特别感兴趣。

参考

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3. Murphy,K. 2016.λ重组和重组,Ecosal Plus 2016. Doi:10.1128 / Ecosalplus。PubMedPMID:27223821

4.Sharan SK, Thomason LC, Kuznetsov SG, Court DL。重组:基于同源重组的基因工程方法。自然协议。2009; 4(2): 206 - 223。doi: 10.1038 / nprot.2008.227。PubMedPMID: 19180090。公共医学中心PMCID: PMC2790811

5.Thomason, L. C., Sawitzke, J. A., Li, X., Costantino, N. and Court, D. L. 2014。重组:同源重组在细菌中的基因工程。《当前分子生物学协议》106:V: 1.16:1.16.1-1.16.39。PubMedPMID: 24733238

6.国家癌症研究所重组页面

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