用saptrap的内源基因的荧光标记

由米歇尔克里琴

自从发现GFP.50多年前,频谱不断增长vwin德赢娱乐平台荧光蛋白(FPs)是研究细胞系统的组织和功能的宝贵资源。FPs已被用于跟踪蛋白质定位、细胞结构、细胞内运输和蛋白质周转率。此外,通过与细胞器相关的FP融合工程,科学家已经能够研究许多细胞过程,包括有丝分裂、线粒体裂变/融合、核输入和神经元运输。尽管FPs能够帮助我们发现许多细胞机制,但是FPs也存在一些局限性。荧光标记蛋白的过表达会导致蛋白质定位不当、蛋白质聚集或蛋白质正常功能的破坏,最终导致蛋白质细胞作用的错误解释。 下载荧光蛋白101电子书vwin德赢娱乐平台

一种避免过表达荧光蛋白融合陷阱的方法是用荧光蛋白融合取代你感兴趣的基因的基因组副本。克里普尔克基因组编辑可以帮助实现这一目标。该系统的力量位于内切核酸酶Cas9在由引导RNA(GRNA)序列规定的基因组位点处在基因组位点产生DNA双链断裂(DSB)的能力。用户可以设计GRNA在特定基因组位点诱导突破,并使用内源性同源性定向途径,可以在DSB插入新的用户定义的DNA序列(如GFP)。CRISPR让科学家们才能标记和轻,以更好地了解正常蛋白质功能的内源性基因。然而,CRISPR蛋白标记确实具有其限制,特别是在尝试执行高通量实验时。如果用户想要执行高吞吐量遗传屏幕,则昂贵且耗时,以单独生成包含用于每个插入的标签的GRNA和同源臂修复模板。此外,筛选含有新标记基因的转基因菌株仍然挑战。大多数插入只能由PCR等劳动密集型方法或通过评估视觉表型来检测。

改善秀丽隐杆线虫用saptrap标记荧光蛋白

Jorgensen Lab.最近开发了一种模块化质粒组装工具SapTrap改善CRISPR基因组标记秀丽隐杆线虫。Saptrap提供科学家的一种方便的一个管组装反应来产生高通量的目标向量。这些向量可以用来标记内源性基因并同时引入用于筛选改性菌株的选择标记。用Saptrap,用户首先设计所需的GRNA靶序列的寡核苷酸或合成DNA,以及5'和3'同源臂修复模板(图1,步骤1)。无需PCR或克隆,因为用SapI酶切目的载体得到2个位点,第一个位点接受U6启动子表达的sgRNA目标序列,第二个位点接受同源臂修复模板。

SAP陷阱组件甲状腺

SapTrap包含一个预构建的供体质粒库,包含几种荧光(EGFP, tagRFP, mCherry)和非荧光(Halo, SNAP)标记,一个可选择的标记(液氧CBR-UNC-119)为了易于筛选插入事件和各种连接器模块(标签和同源臂之间的连接器序列)。用SAPI消化供体质粒允许释放标签,选择标记和连接器(图1,步骤2-3)。由于相同类型的供体质粒将产生相同的独特的SapI 5’悬空,因此可以使用库中连接器和标签供体质粒的不同组合来生成功能独特的修复模板。最后的连接反应正确地组装了最终的目标载体(图1,步骤4),并且共注入靶向载体和Cas9表达质粒将将所需的遗传标签和标记序列插入靶向基因座中。可选择的标记可以通过CRE介导的切除无疤标签插入。

除了用于标记单个遗传基因座的明显优势,工具包还提供了用于以组织特异性方式标记蛋白质的修复模板,以及用于在多个靶位点插入标签的3位目的地矢量。Saptrap载体可以很容易地修改为标记数百个基因,产生强大的遗传筛查库。

额外的蛋白质标记系统

对于那些不工作的人秀丽隐杆线虫,几个研究小组已经设计了模块化工具包,以帮助标记其他模型系统的基因组位点,包括哺乳动物细胞。

  • crispr辅助插入标记,由霍农实验室,允许用户在人细胞中容易地创建内源基因的C末端标签融合。要使用脆,用户需要3个载体:1)靶向感兴趣的基因的GRNA载体,2)质粒,以指定插入的读数框架,3)含有所需标签的载体,可以获得作为a通用供体质粒。的CRISPaint工具包包括几种用于蛋白质标记的供体质粒,包括荧光素酶(NANOLUC),荧光蛋白(TAGGFP2,TAGBFP,TAGRFP和T2A-Turbogfp-PEST)和小表位标签(vwin德赢娱乐平台HA,MYC,Strep Tag II,Avitag,Halotag,Spytag)。

  • Foerstemann实验室开发了一种基于聚合酶链反应(PCR)的系统,该系统允许用户生成一个包含所需gRNA与U6启动子直接融合的质粒,以及一个包含同源臂和N-或c -末端标签的第二个质粒。然后将两种PCR反应混合,并与Cas9表达载体一起转染。它们也可以被直接引入果蝇S2细胞系稳定表达Cas9。该PCR工具提供C-和n -末端标记载体(如GFP, Flag, YFP, Strep, TEV-V5)与blasticidin或嘌呤霉素选择。

  • Allen Cell Science研究所的研究人员最近开发了一个质粒的集合用荧光标记哺乳动物细胞中的细胞结构标记物。在CRISPR/Cas9诱导的断裂后,vwin德赢娱乐平台这些质粒使用荧光蛋白来促进同源性修复。了解更多关于这些结构和它们在艾伦研究所被用来创建的细胞系的信息最近的博客文章

  • 更多关于用于内源性蛋白质标记的其他CRISPR/Cas系统的信息,请访问我们的网站CRISPR/Cas质粒-蛋白标记

除了简单地监测蛋白质定位和活性外,CRISPR标记系统还可以修改以检测其他蛋白质特征。例如,Masato Kanemaki's实验室开发了一个基于CRISPR/ cas的系统,用于标记内源性蛋白质与生长素诱导degron (AID)标签,以产生蛋白质可以迅速可逆地在培养基中添加生长素后降解。任何数量的调控序列,包括蛋白增强子和阻遏子,都可以被包含在修复模板中,用于诱导蛋白表达水平的改变。

CRISPR标记系统为用户提供一种简单有效的方法来标记内源性蛋白质,用于研究蛋白质表达,定位和蛋白质 - 蛋白质相互作用。此外,由于Saptrap等标记系统中包含的矢量的模块化布置,科学家们将能够在内源基因座中产生含有荧光标记蛋白的基因组文库,以先前未知的蛋白质功能脱落。


参考文献

Schwartz, Matthew L.和Eric M. Jorgensen。“SapTrap,一个用于线虫高通量CRISPR/Cas9基因修饰的工具包。”遗传学。202(4)(2016):1277 - 88。PubMedPMID: 26837755。公共医学中心PMCID: PMC4905529

Schmid-Burgk, Jonathan L.等人,“CRISPaint允许使用连接酶-4依赖的机制进行模块化碱基特异性基因标记。”Nat Commun. 7(2016):12338。PubMedPMID:27465542。公共医学中心PMCID:PMC4974478.

Natsume, Toyoaki, et al.,《生长素诱导Degron标签与短同源供体在人类细胞中的快速蛋白质消耗》。细胞Rep.15(1)(2016): 210 - 8。PubMedPMID: 27052166

Kunzelmann,Stefan等。“在培养的果蝇黑素转酯细胞中进行基因组编辑的综合工具箱。”G3(Bethesda)6(6)(2016):1777-85。PubMedPMID: 27172193。公共医学中心PMCID: PMC4889673

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