用CRISPR/Cas9定位4D核仁

由玛丽传动装置

似乎每周都有一项新的CRISPR进展或技术发表!最新的应用之一是使用荧光标记Cas9标记活细胞中的多个基因组位点的彩色系统。而其他系统可以用来标记基因座,如荧光原位杂交(FISH)或荧光标记的故事,CRISPR / Cas9易用性和标签直播能力使得该系统真正有利。这种新技术,开发Thoru Pederson的实验室这让我们离绘制4D核组(即细胞核在空间和时间中的组织)更近了一步,也让我们更了解细胞核的组织在整个细胞生命中是如何变化的,或者在疾病状态下组织是如何改变的。

DCAS9获得了丰富多彩的改造

即使没有其核酸酶活,催化死Cas9 (dCas9)有许多应用,最著名的是转录激活/抑制。dCas9以前也被改造过荧光标记符合其GRNA的序列,促进特定基因座在特定基因座的染色质动力学的实时研究。对该系统的限制是单色标签;多色标记将使多个基因座的可视化。然后可以使用这种系统来检查和校唤性间动态,以及它们如何响应细胞周期或其他刺激而改变。

Live Cell双色Crispr在人染色体上的两个基因座标记。要创建一个彩色的Cas9工具箱,马等。转而研究SpCas9及其同源物NmCas9和St1Cas9。每一种同源物都与一种不同的荧光蛋白融合,产生三种颜色。这些同源的特异性是关键:由于差异在PAM序列根据每个同源的要求,为一个dCas9设计的gRNA应该是特定于该同源的,而不是与其他同源的串扰。

Ma等人使用特定于端粒序列的gRNAs测试了他们的dCas9变体,发现不同荧光标记的dCas9异构体可以有效地定向到适当的目标序列。他们还能够使用针对9号和13号染色体序列的gRNAs标记两对不同的染色体。

接下来,他们将注意力转向染色体内基因座的定位。该技术成功地解析了物理图谱距离为75和2 Mbp的位点,计算出的荧光距离与之前建立的物理图谱相关。在比较~ 2mbp的目标对时,他们注意到,即使在这么小的距离,他们也可以评估染色质压缩的程度!据作者所知,这部作品代表了第一次映射雄oromal基因座,是表征4D核组的主要基准。

未来的修改和应用

Ma等人利用标准荧光显微镜开发了这项技术,但由于其分辨率较低而受到限制。这种方法与超分辨率显微镜相结合可以提高分辨率,但背景信号可能是一个问题。这项研究的另一个警告是该方法的敏感性。作者估计,至少150-200个荧光蛋白分子是必要的一个可检测信号,限制了该技术的灵敏度。一个可能的解决方案是SunTag,一种合成支架,可用于招募多个蛋白质分子(也可以从Addgene!)由于SunTAG提供的信号水平是如此之高,因此可以在较低的照明设置下进行细胞,降低光漂白和光毒性问题并延长该技术的潜在成像时间。

NIH常见基金已经取得了映射4d核作为研究人员努力增加我们对染色质组织的理解的特定优先权。基于荧光卷曲/ Cas9的方法是基因组基因座的活细胞成像前进的大步。马等。预期该技术适用于对外部刺激的细胞周期进展,表观生物学和细胞反应的研究。它还可以对癌症具有主要应用,例如染色体易位或染色体碎片(Chromothripsis)的可视化。正如本研究加入万神殿一样有用的CRISPR / CAS9技术,我们在Addgene很高兴看到下一个即将到来!

参考

人类细胞染色体位点的多色CRISPR标记。Ma H, Naseri A, rees - gutierrez P, Wolfe SA, Zhang S, Pederson T. Proc Natl Acad Sci . 2015 Mar 10;112(10):3002-7。doi: 10.1073 / pnas.1420024112。2015年2月23日。PubMed.

利用优化的CRISPR/Cas系统动态成像活的人类细胞基因组位点。Chen B, Gilbert LA, Cimini BA, Schnitzbauer J, Zhang W, Li GW, Park J, Blackburn EH, Weissman JS, Qi LS, Huang B. Cell. 2013 Dec 19;155(7):1479-91。doi: 10.1016 / j.cell.2013.12.001。PubMed.

基因表达和荧光成像中的信号放大蛋白标记系统。Tanenbaum Me,Gilbert La,Qi Ls,Weissman Js,Vale Rd。细胞。2014年10月23日; 159(3):635-46。DOI:10.1016 / J.Cell.2014.09.039。EPUB 2014年10月9日。PubMed.


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