移动式Crispri:将CRISPRI带给不同的细菌

由贝丝学会主席

绝大多数细菌是未经驯化的,这限制了科学家用来研究它们的工具。例如,基因敲除CRISPR干扰(CRISPRi)仅限于实验室适应的细菌,因为它一直挑战将Crispri机器引入不同的细菌种类。现有方案可以将CRORPRI转化为单个细菌应变,例如aB.枯草芽孢杆菌或狭窄的细菌种类,如人体肠道细菌B. Thetaiotaomicron分枝杆菌假单胞菌,大肠杆菌。然而,许多非模型细菌种类缺乏遗传工具。

移动 - 克里普利来自实验室杰森彼得斯奥伦罗森伯格,卡罗总提供了一套精简的工具,用于在许多类型的细菌中使用CRISPRi:实验室适应的、环境隔离的和与疾病相关的。

移动式CROSPRI:CRISPRI转移的模块化方法

移动CRISPRi模块化组件与现有的细菌CRISPRi方法相比,Mobile-CRISPRi有两个优势。首先,其模块化设计允许定制菌株特异性启动子、抗生素抗性选择标记、gRNAs和dCas9蛋白。其次,它可以被引入更广泛的细菌中。一旦转移,Mobile-CRISPRi稳定集成到基因组中,并在正常的DNA复制和细胞分裂中繁殖。Mobile-CRISPRi不会破坏基因功能,而且在超过50代的情况下都是稳定和活跃的。

通过细菌共轭引入移动式Crispri的两种方法

对于革兰氏阴性菌,Mobile-CRISPRi是利用该细菌引入的TN7转座系统。该系统由两部分组成:表达Tn7转位基因的质粒(TNSA.TNSB.TNSC.TNSD.,TNSE.),以及含有Mobile CRISPRi盒式载体的质粒,盒式载体两侧分别有左、右Tn7末端序列。在三亲代交配计划中,带有RP4转移机制染色体副本的供体细菌动员这些质粒转移到受体细胞。Mobile-CRISPRi整合了高度保守的谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶()受体细菌中的基因由于TNSD,序列特异性DNA结合蛋白。选择除去供体细菌和受体细菌,缺乏移动式Crispri的综合染色体拷贝。

对于浓郁的革兰氏阳性细菌,使用移动式克隆细菌整合和接合元素枯草芽孢杆菌(ICEBs1)系统。Icebs1携带缀合所需的基因,但也可以携带货物基因,如移动式Crispri。移动-Crispripli冰元件首先被引入B.枯草芽孢杆菌基因组。然后转移移动 - 克里普利B.枯草芽孢杆菌对接下来感兴趣的细菌IPTG诱导共轭基因和双父母交配。从切除后B.枯草芽孢杆菌基因组,移动式芯片冰元件形成缀合的质粒样DNA圆,并转移到接受者细菌中,在那里它将其整合到TRNS-LEU2.轨迹。

移动式CRISPRi接合方法

该团队表明,Mobile-CRISPRi可转移到多种细菌物种中,包括与人类疾病有关的几种细菌。然而,转移的速率是可变的。他们通过比较在选择性培养皿中生长的菌落数量和在非选择性培养皿中生长的菌落数量来测量转移速率。大多数测试的细菌每100到1000个菌落中有1个转移,但有些细菌,包括E. FAECALIS.P. Mirabilis.,每1,000,000个殖民地只有〜1次。更高的转移率更适合基因组 - 宽的Crispri库筛查实验在维护库多样性很重要的情况下,较低的转移率仅适用于单基因敲低实验。

移动 - CRISPRI应用程序

Mobile-CRISPRi将CRISPRi扩展到非模型细菌,包括致病性菌株和环境分离物。例如,Peters和他的同事们使用Mobile-CRISPRi基因敲除了几种与人类疾病(S.金黄色葡萄球菌肺炎克雷伯菌,P.铜绿假单胞菌)除了vicrio casei,从乳酪隔绝的细菌。通过敲低的细菌菌株的敲低来测量的敲低效率,从细菌菌株的变化,降低〜8至150倍,在测量的所有物种上,中值敲低〜40倍。

除了了解细菌的基本生物学,Mobile-CRISPRi还可以用来识别抗生素耐药性基因。作为抗生素靶标的基因往往是必需的基因,这给研究它们带来了挑战,因为它们的完全击倒是致命的。然而,不完全或可滴定的基因敲除可以使细菌存活,并使研究人员能够研究该基因是否是抗生素的目标。例如,让我们来看看基本基因folA它编码抗生素Trimethokim的靶标。什么时候肠杆菌空气原味肺炎克雷伯菌,P.铜绿假单胞菌(所有机会主义病原体)在Trimethokim的存在下生长,用a治疗的培养物folA与对照GRNA处理或未治疗的细菌相比,GRNA对TrimethechoLim更敏感。有这一点folA基因产物不是Trimethokim的靶标,敏感性没有变化。

汇集击倒也可以使用Mobile-CRISPRi。作为原理的证明,Peters和他的同事们构建了一个有40个成员的文库,以20个基因为目标肠杆菌属下水道,一种是正常人体肠菌群的一部分的细菌。指南针对每种基因两种指南的必要性和非必需基因。图书馆在葡萄糖最小培养基中生长了100倍的野生型细菌,并且在6至12代或不诱导CRISPRI敲击后测量40种文库菌株中的每一个的相对频率。正如预期的那样,表达目标基因的细菌表达指导物的指导物较少,而靶向非必需基因的含细菌的导向仍然是恒定的,则健身效应在12次倍增时更明显比在6倍。

移动式Crispri的关键外来

Mobile-CRISPRi可用于非模型细菌物种,其模块化特性允许定制向导、启动子、选择标记和不同版本的dCas9。在整合后,Mobile-CRISPRi可以稳定表达,无需选择,且可滴定的敲低允许对必要的基因进行研究,如那些涉及抗生素耐药性的基因。你准备好移动Mobile-CRISPRi到你感兴趣的细菌吗?找到Mobile-CRISPRi质粒在Addgene!

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参考文献

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