在复杂的美唑烷中，快速细胞分裂和大规模细胞流动性是胚胎发育期间的必要过程。越来越多的生物需要这些生物是从一丛细胞到完全分化的身体的复杂过渡。相反，这些动态过程在成年生物体中缺乏不存在，其中组织结构更稳定，局部运动占主导地位（例如，迁移到上皮的基础祖细胞）。在这个阶段，只有来自的细胞免疫系统以骨髓和其他淋巴器官移动到特定组织的宽度移动性，他们可以扫描任何危险的迹象。在这篇文章中，我们将专注于如何vwin德赢娱乐平台可以并且已被用于监测免疫系统中的蜂窝运动。这里使用的技术可以适于研究其他系统，其中在整个生物体中存在大规模的细胞运动。
在这些复杂的环境中研究细胞流动从未容易容易，多年来，研究人员缺乏良好的工具，直接遵循淋巴器官中的免疫细胞。细胞分选仪的发展与荧光标记的抗体的工程一起使得可以将细胞从一个器官追踪到另一个器官。因此，几个实验室能够破译淋巴细胞的行程，从骨髓到胸腺，在那里他们获得其特异性或从胸腺到淋巴结。这些方法给研究人员提供了关于免疫细胞迁移率的更多信息，而不是过去的化学着色淋巴器官的静态显微镜图像。
研究人员如何跟踪荧光标记的细胞？
1.渗流荧光显微镜
该技术使用荧光显微镜，其中光源安装在上方（EPI）标本和激发光通过显微镜物镜朝向样本。它允许在样本中表达的荧光蛋白的可视化。vwin德赢娱乐平台
2.荧光激活细胞分选机（FACS）
根据它们是否已被标记为荧光蛋白或其标记的机器染料。它在振动喷嘴中机械地将细胞分离在振动喷嘴中，向荧光的细胞赋予阳性或负电荷，然后通过电池通过电场将它们转移到适当的容器中。该机器可用于区分被不同荧光蛋白或染料标记的细胞群。vwin德赢娱乐平台
3.双光子显微镜
3.双光子显微镜双光子激发显微镜是一种荧光成像技术，允许在深度上达到约1毫米的活组织。两个低能量光子（通常来自相同的激光）配合在荧光分子中引起更高能量的电子转换（参见右图）。由这些双光子产生的激发仅发生在所选择的焦卷体中，因此显微镜仅捕获来自该体积的荧光。结果是您可以检测厚标本中的信号。从PLOS病原体中看到下面的视频，从PLOS病原体中查看两光膜滚动显微镜Kamenyeva等，2015年。
荧光蛋白能够实现细胞贩运研究vwin德赢娱乐平台
通过晚期优化GFP及其衍生物Roger Tsien.改变了一切。首次，荧光蛋白给研究人员能够在器官内跟踪vwin德赢娱乐平台免疫细胞并想象细胞在特定刺激后的相互作用。使用ePiforEcence显微镜和GFP融合蛋白由特定于免疫谱系的启动子控制，科学家们可以容易地跟踪表达GFP的细胞。例如，通过在抗原攻击后不同时间的淋巴结收获淋巴结，科学家能够跟踪GFP标记的B细胞的这些器官的切片。这些GFP标记的细胞也可以通过细胞分选者跟踪，使免疫学家能够计数细胞和统计分析细胞运动的能力。通过使用由荧光化学物质或其他荧光蛋白标记的细胞，实验室也能够看到几种不同免疫细胞之间的运动和相互作用。vwin德赢娱乐平台这些方法允许免疫医生开发一种免疫反应的时尚观点，但是对这些动态的研究仍然艰苦，因为离荧光显微镜不能实时发出明确的细胞运动视图。
双光子显微镜是细胞成像的下一次革命，使研究人员能够实时监测蜂窝运动的能力。本技术首先在2002年期刊中的三篇论文引入免疫学。现在，这种技术和体内活细胞成像（流管高学成像）研究其使能揭示了在不同组织环境中介绍适应性和先天免疫的蜂窝行为。这些研究提供了细胞运动，相互作用和响应动态的定量测量。
在过去的15年里，已经努力创造转基因小鼠在免疫谱系中表达荧光蛋白报告构建体。通过特别标记T细胞，B细胞和抗原呈现细胞，科学家能够在淋巴器官中解密蜂窝动态。例如，在淋巴结中，双光子显微镜允许科学家更好地了解适应性免疫应答中的T细胞启动。众所周知，T细胞能够从血液中移植到侵入淋巴结和扫描抗原呈递细胞，但双光子显微镜使科学家能够看到扫描的混乱和随机性如何以及快速T细胞可以从诸如抗原跳跃的混乱和随机性。细胞到另一个。实际上，我们现在知道T细胞能够比身体中的任何其他细胞类型更快速地爬网！
由双光子显微镜技术提供动力的腔内成像已经未覆盖宿主病原体相互作用，导致感染组织中的效应功能的理解。在使用双光子成像之前，我们对病原体 - 免疫细胞相互作用的理解依赖于体外研究难以逮捕了存在的专业细胞类型和器官的关键作用体内。荧光病原体和荧光细胞的使用使科学家能够监测不同组织中的细胞相互作用，包括淋巴结，脑，肝，肠和皮肤。
双光子呈动脉显微镜。上面的视频描绘了在感染后表达Lysm-GFP（绿色）的中性粒细胞渗透到排水淋巴结中S.金黄色葡萄球菌（红色的）。然后，你可以看到蜂窝群S.金黄色葡萄球菌吃细菌。
众多科学家的一些科学家已经能够使用双光子显微镜帮助答案包括：
- T细胞和/或中性粒细胞如何前往感染或损坏部位（Peters等人。2008年那Chtanova等人。2008年那Kamenyeva等。2015年）？
- 血液在免疫反应期间如何血液单核细胞巡逻血管（Auffray等人。2007那Finsterbusch等人。2016年）？
- 树突细胞如何迁移到淋巴结以激活T细胞（Celli等人2008那Kitano等人。2016年那Cavanagh等人。2008年）？
两个光子显微镜的技术挑战
流体性成像是了解身体在稳定状态下或物理病理挑战下的内容发生的简单方法。然而，必须考虑技术特异性，特别是在使用荧光蛋白来跟踪细胞运动和相互作用。vwin德赢娱乐平台即使几乎所有荧光蛋白都可以用于您的实验中，经vwin德赢娱乐平台验表明，在跟踪细胞上有些更可靠，更有效。使用标准TI时的良好的双光子探针：蓝宝石激光包括：
- 蓝绿色荧光蛋白如EGFvwin德赢娱乐平台P
- 黄色橙色荧光蛋白，如TAGRvwin德赢娱乐平台FP，TDTOMATO，DSRED，MKATE系列或TDKATUSHKA2（Drobizhev等人。2011年）
常用的橙色和红色荧光蛋白激发为750nm至760nm激光，使使用蓝vwin德赢娱乐平台色或青色蛋白质的双色成像研究而不改变激发波长（Salomonnson等人。2012年）。它们也可以在1,000nm和1,200nm之间有效地振兴，其中组织吸收相对较少，组织散射弱，少量组织自动荧光（Drobizhev等人。2011年）。但这需要其他激光器而不是标准Ti：蓝宝石激光。对于精细调谐激发波长也很重要，因为已经表明激发波长的小增量变化可以显着影响来自荧光蛋白的排放强度（Salomonnson等，2012）。vwin德赢娱乐平台
最后，值得测试的是值得的荧光蛋白的光稳定性当使用2-光子显微镜时，这对于许多荧光蛋白质没有很好地报道。vwin德赢娱乐平台
额外的荧光蛋白工具
可光定位的荧光蛋白vwin德赢娱乐平台（在光诱导的化学反应后发泡的蛋白质）或光可逆的Keade蛋白（经历光诱导的来自绿色荧光到红色荧光的蛋白质）也是用膀胱成像使用的有用工具。这些工具允许人们通过在特定时间标记细胞来研究细胞迁移和运动的动力学。例如，可光激活的荧光蛋白已成功vwin德赢娱乐平台地用于研究小鼠淋巴结的发芽中心内的B和T细胞动态。但是，在使用光激活的FPS时必须注意时间尺度 - 标记单元格内的劣化限制了可用于跟踪某些单元格类型的时间表。
标记和跟踪单元格的另一个有用工具是CRE / LOX重组系统。研究人员可以用LOXP位点在质粒中侧翼荧光蛋白vwin德赢娱乐平台，使得它们的表达在表达CRE的细胞上打开或关闭。这样的系统的结果是用不同荧光蛋白标记的细胞的马赛克。vwin德赢娱乐平台使用此系统的一次迭代调用脑袋，ubow鼠标菌株已经创建，分别为皮肤和淋巴结内的含卵叶植物细胞和卵泡树突细胞命运。与可光活化或光可逆转的蛋白相比，使用CRE-LOX的细胞永久标记是有利的，因为它能够在整个细胞的整个寿命过程中跟踪。
过去15年来看，荧光蛋白的使用和膀胱内成像在理解免疫细胞触发免疫应答的关键作用方面存在很大的发展。vwin德赢娱乐平台在双光子vwin德赢娱乐平台显微镜下可以更有效地使用新的荧光蛋白，并且新的构建体促进了可以用于命运映射实验的小鼠线的产生。由于这些技术，免受这些技术的影响，但仍然存在许多问题。使用其他技术，如Optimetics.和CRISPR / CAS9.将帮助免疫学家创造更好的工具和模型，以进一步了解免疫系统及其动态。
参考
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