vwin德赢娱乐平台荧光蛋白101:荧光蛋白计时器

由泰勒福特

泰勒福特
甚至在荧光蛋白(FPS)vwin德赢娱乐平台以广泛使用之前,也有多种方法可以监测细胞,细胞器和蛋白质定位。例如,您可以在显微镜下染色并在显微镜下看待它们,分馏样品以隔离特定的细胞器及其内容物或表现原位杂交实验。在很多情况下,荧光蛋白已经取vwin德赢娱乐平台代了旧的方法,或者以更容易的方式补充它们。这是一种特殊的FPs类型FP定时器,为监视本地化添加整个新维度;使用FP定时器,研究人员可以看一下细胞的唯一图像,并了解蛋白质定位如何随时间变化。
荧光蛋白定时器的标志


荧光蛋白定时器的理论性质

当FP定时器第一次表达时,它们主要发出一种颜色的荧光,但慢慢成熟,直到它们主要发出第二种颜色的荧光。这种变化通常被认为是发色团氧化的结果。一些更流行的定时器(无论是作为蛋白质融合的一部分或独立表达)最初发出绿色或蓝色的荧光,当它们成熟时,发出红色的荧光。在计时器的填充中,成熟颜色(红色)与不成熟颜色(绿色或蓝色)的比率表明池的年龄:比率越高,池越老。

自2000年以来,FP定时器已经存在Terskikh等人。报告生产DSRED E5.。该计时器在18小时内可预测从绿色到红色荧光(500至580nm)的转变体外(见Terskikh等人的图1B),甚至显示了14小时表达的可预测动力学C. Elegans.胚胎。但是,这个初始计时器是一个带有一个四聚体衔接倾向在细胞中(Tsuboi等。),限制了它的使用。尽管如此,其创造者已经注意到了几个现在已成为理想的FP定时器的标志的特性:

1.比例测定表达时间

FP定时器的成熟荧光与未成熟荧光的比值为依赖于总体表达时间独立于蛋白质浓度。因此,校准曲线因此可以使用与总表达时间相关的校准曲线来确定FP定时器池在整个细胞中表达的长度,或者作为局部融合蛋白质局部化为细胞的特定区域。例如,如果红色/绿色荧光的比率落在图1B所示的理论计时器的线性窗口内,则可以使用该等式适合该线性区域以解决总表达时间。

2.具有单个基因的定时器功能

虽然可以使一个由两个单独的fps组成的定时器系统(一个快速地成熟的一个单独的fps系统,但请参阅Verkhusha等人。),常见FP定时器的一个好处是,你可以通过表达单一的FP定时器蛋白质或蛋白质融合来监测年龄。这种蛋白质方法简化了克隆,使您的实验设置不那么麻烦。

3.跨多个系统的可移植性

Terskikh等人。表明它们可以使用它们的多功能计时器体外在哺乳动物细胞中,在C. Elegans.,在Xenopus.胚胎。当然,定时器可能对氧气、温度和pH值的变化很敏感,但定时器的活动可以根据这些不同的条件进行校准,从而在许多实验设置中使用给定的定时器。

单体荧光蛋白定时器

自从2000年首次生产FP定时器以来,研究人员已经认识到四聚体荧光蛋白聚合倾向的问题。vwin德赢娱乐平台细胞毒性、不正确的定位和功能下降都是FP聚集的可能后果,如Erik Snapp的博客文章表演。避免这些问题,Subach等人。Tsuboi等。开发的单体FP定时器具有较少的骨料倾向。

这些单体FP定时器(来自Tsuboi等人的mK-GO和英国《金融时报》系列来自Subach等人的)分别来自先前开发的单体荧光蛋白mKO和mCherry。vwin德赢娱乐平台Tsuboi等人在试图以其他方式增强mKO时,偶然地开发了mK-GO,而Subach等人利用他们对蛋白质结构和饱和诱变的知识共同努力开发了他们的FT系列。mK-GO由绿色变为红色,FT系列由蓝色变为红色(发射光谱和吸收光谱见表1)。Subach等人的定向诱变也产生了表中所示的三个独立计时器:Fast-FT、Medium-FT和Slow-FT。这些蛋白显示出逐渐变长的蓝色荧光成熟时间和不同的蓝红成熟时间(表1)。这些单独的蛋白对于监测不同时间尺度下发生的细胞事件很有用。

表格1:来自Subach等人的单体FP定时器和相关质粒。

蛋白质 激发(nm) 发射(nm) 亮度 pKa 成熟 质粒
快速FT. 403(蓝色),583(红色)

466(蓝色),606(红色)

14.9(蓝色),6.8(红色) 2.8/4.1 7.1h(红色)

pFast-FT-N1

pTRE-Fast-FT
pBAD / HisB-Fast-FT

中英尺 401(蓝色),579(红色) 464(蓝色),600(红色)

18.4(蓝色),5.8(红色)

2.7 / 4.7

3.9 h(红色)

pmedium-ft-n1

pTRE-Medium-FT

pBAD / HisB-Medium-FT

慢速 402(蓝色),583(红色) 465(蓝色),604(红色)

11.7(蓝色),4.2(红色)

2.6 / 4.6

28小时(红色)

pSlow-FT-N1

pTRE-Slow-FT

pBAD / HisB-Slow-FT-

荧光蛋白计时器的应用

FP计时器已被用于:

  • 通过将各种囊泡融合到FP定时器mk-GO,监测囊泡融合和从质膜释放的动态(Tsuboi等)。
  • 通过将FP定时器DsRed-E5置于控制之下,监测正在发育的胰腺中的基因表达neurog3.(一种控制胰腺分化的基因)Miyatsuka et al。
  • 通过将Medium-FT融合到LAMP-2A(一种溶酶体相关的膜蛋白),并随着其亚细胞定位时间的推移,来区分转运到溶酶体的模型(Subach等人)。
  • 监测合成电路中的蛋白表达动态(Saxena等人

在一般意义上,FP定时器可用于任何人想要了解细胞,蛋白质或细胞结构的年龄与特定生物事件(贩运亚细胞位置,基因表达的开始,发育细胞结构等)。因此,FP定时器应在动物发育的研究中找到用于动物发育的事件,如初始组织的图案化的事件和肢体的形成与基因表达的变化相关。例如,在开发胚胎中,研究人员可以确定新合成或长寿命的转录因子是否形成基因表达中的总变化,因为形成新的身体部分。在合成生物学中,FP定时器可能能够讲述研究人员在产生感兴趣的化合物时旧细胞更好,因此允许它们优化复合生产过程。

你是如何使用FP定时器的?你是否计划以一种新的创造性的方式使用FP定时器?请在下面的评论区告诉我们!

下载荧光蛋白101电子书vwin德赢娱乐平台


参考文献

1.Terskikh, Alexey等。"荧光计时器":随时间变化颜色的蛋白质。"科学290.5496(2000): 1585 - 1588。PubMed.PMID: 11090358

Tsuboi,Takashi等。“新开发的单体荧光定时器蛋白显示出神经内分泌细胞的年龄依赖性优先浓度囊泡卵泡症。”细胞的分子生物学21.1(2010): 87 - 94。PubMed.PMID: 19889833。pmed中央PMCID: PMC2801723

3.Verkhusha, Vladislav V.等。红色荧光蛋白DsRed的增强突变体,用于神经纤维束形成的双标记和发育定时器生物化学杂志276.32(2001):29621-29624。PubMed.PMID: 11408473

4. Subach,Fedor V.等人。“改变颜色的单体荧光定时器从蓝色变为红色报告的细胞贩运。”自然化学生物学5.2(2009):118-126。PubMed.PMID: 19136976

5. Miyatsuka,Takeshi,Zhongmei Li,以及Michael S.德国人。“颞细胞标记揭示了胰岛分化的年表。”糖尿病58.8(2009): 1863 - 1868。PubMed.PMID:19478145.。pmed中央PMCID:PMC2712795

6.Saxena, Pratik等。“一个可编程的合成谱系控制网络,它将人类诱导多能干细胞分化为葡萄糖敏感的分泌胰岛素的类β细胞。”自然通信7(2016)。PubMed.PMID:27063289.。pmed中央PMCID:PMC4831023.

Addgene博客上的其他资源vwin.com mobile

资源在Addgene.org

话题:vwin德赢娱乐平台vwin德赢娱乐平台荧光蛋白101.

留下你的评论

分享科学刚刚变得更容易...订阅我们的博客

订阅