与意大利面条怪物的神经元标记

由Benoit Giquel.

SMFP意大利面怪物蛋白质结构

中枢神经系统(CNS)协调复杂的进程,使有机体能够控制他们的运动和行为。这些功能和其他功能由神经元的集合来控制通过突触连接的复杂进入电路(牧羊人,2004)。了解这些神经回路的结构和功能对神经科学研究至关重要。利用基因工具来可视化和扰乱神经回路,再加上将基因传递到中枢神经系统的方法的发展,使得绘制这些神经元网络变得更加容易。

近三十年,重组adeno相关病毒(aav)由于其低细胞毒性,低免疫原性和AAV的长期表达,已被广泛用于向大脑提供遗传工具。AAV血清型已被广泛研究,以便定义靶向大脑中特异性神经元群的那些。这艾伦研究所Janelia研究校园在美国已经使用AAV1和AAV2血清型来创建一个小鼠大脑图谱。这个图谱使研究人员能够快速找到最佳的AAV血清型,以瞄准他们正在研究的神经元。多亏了这项工作,现在在你最喜欢的神经元群体中表达分子和追踪与该群体的联系就容易得多了。

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常见基因编码神经元示踪剂的局限性

神经元示踪剂,如表位标记和vwin德赢娱乐平台荧光蛋白(FP)在绘制、监测和操纵神经元回路方面也很重要。表位标记是短的抗原多肽序列,连接到一个感兴趣的蛋白(POI),促进免疫组化(IHC)实验与标记特异性抗体。最著名的是流感血凝素(HA),髓细胞瘤病病毒致癌基因(myc),猴病毒5衍生表位(V5),合成肽FLAG,合成链霉亲和素结合链标签,以及最近的OLLAS (大肠杆菌OmpF链接器和小鼠langerin)和Sun Tag (Viswanathan 2015)。

抗原表位标记用于免疫组化的主要优势是可获得可靠的一抗进行检测,特别是当POI的抗体是非特异性的、与其他抗体发生交叉反应或完全不可用时。另一个优点是这些标签很小(8-12个氨基酸),既不会干扰POI折叠,也不会干扰其与细胞内的蛋白质伙伴相互作用的能力。然而,抗体对这些标签的亲和力很低,当POI弱表达时,即使是多聚标签也常常不足以检测。由于这些表位标签没有固有的视觉信号,因此不能在活体成像实验中直接检测到。因此,很难使用表位标签来监测单个分子——例如,研究人员经常想在神经元突触上做的事情。此外,这些标签需要融合到支架蛋白,以便在神经元中稳定表达。

与表位标签相比,FPS是本质上荧光的,因此可以在实时成像实验中用于研究神经元电路和动力学至关重要。FPS通常是明亮的,稳定且细胞耐受性。它们可用于蛋白质定位,隔离和跟踪实验(里索,2009)。使用许多不同的FPS,在可见频谱上发射,研究人员还可以在单​​一实验中使用多个FP,并立即可视化许多分子或结构(Shaner,2007年)。与表位标签相比,FPs更大,它们与POI的融合可以影响蛋白质折叠和蛋白质间的相互作用。此外,FPs的过表达可以引发蛋白质聚集,这对细胞是有毒的,并影响标记小结构,如神经突起。与表位标签一样,低FP表达可能不足以监测弱表达的POI。

意大利面条怪物 - 一种新的和改进的神经元示踪剂

由于表位标记和荧光蛋白的局限性,开发新的能够准确标记神经元的示踪剂至关重要。vwin德赢娱乐平台如上所述,弱表达蛋白尤其难以用这些经典探针追踪。为了克服现有FP和表位标记的局限性,研究人员在罗兰Looger的实验室已经开发了结合两者优点的新的分子标签(Viswanathan, 2015)。对于Looger的团队来说,理想的探针应该结合FPs的溶解度、细胞耐受性和选择性荧光与表位标记的容易抗体识别。因此他们创造了抗原蛋白标签“意大利面怪物”荧光蛋白(SMFPS)vwin德赢娱乐平台。smFPs实际上是由FPs融合到多个表位标签组成的。实际上,创建SMFPLooger的团队有策略地将10到15个单表位标签的拷贝插入到单个FP支架中,这些FP支架要么是完整的,要么是染色团变暗的。这些探针本质上都是荧光的,可以检测高表位特异性,荧光标记抗体。

“意大利面怪物”的名字是指社会运动的神,飞行意大利面怪物教堂;smFP结构类似于神的图像(参见上面的对比图)。飞行意大利面怪物教堂是反对公立学校智能设计教学的象征,并于2005年在俄勒冈州立大学毕业的物理毕业的堪萨斯州堪萨斯州。

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利用smFPs

1.多通道Connectomic示踪剂

多色标记与smFPs

vwin德赢娱乐平台诸如GFP的荧光蛋白已被使用很长时间作为研究Connectomics的探针(如何组织神经电路以及神经元如何彼此连接)。结合AAVS,FPS可以在大脑中容易地表达,并且可以通过其直接荧光信号或使用抗FP抗体来检测。

GFP仅在单个通道中发光。在多色成像实验中,第二种颜色通常由红色荧光蛋白如TDTOMATO或RFP或蓝荧光蛋白如青色提供。vwin德赢娱乐平台这些FPS的问题是它们比GFP更少。此外,其信号的基于抗体的扩增弱并增加了背景荧光。此外,许多这些FPS是细胞毒性的,容易产生聚集并与抗GFP抗体交叉反应,使它们难以在多色/多通道成像设置中使用。相比之下,SMFP标签可以通过不同的荧光团标记的抗体来识别,具有非常特异性的反应性,使得它们对比标准FPS的多色成像实验更有用。因此,LOOGER实验室能够使用SMFP和标准神经元示踪剂轻松执行四色标记实验。

2.神经元亚细胞结构的可视化

GFP在标记中枢神经系统亚细胞结构方面的能力是有限的。GFP和其他FPs倾向于明亮地标记躯体,而不是神经元过程。相比之下,smFPs可以高保真地标记精细的神经元结构,且浓度低于GFP。smFP可以通过其多重的、高亲和力的一抗结合位点更好地标记这些精细结构,该位点可用于在亚细胞结构中放大直接smFP信号。例如,smFPs已经被用来可视化海马CA3锥体神经元中的“多刺的赘生物”(TE)棘,这是众所周知的难以标记的。也有研究表明树突在Stratum oriens.Stratum Levosum分子被更好的解决使用smfp_flag而不是gfp。

3.增强分辨弱表达和/或相似蛋白的能力

通过其多重、高度特异性的抗体结合位点和基于初级抗体的检测,smFPs为弱表达蛋白创造了比标准标签更亮的信号,并可用于区分高度相似的蛋白。例如,n-钙粘蛋白(cadherin-2)是一种突触后细胞粘附蛋白,在神经发育中起着关键作用。它属于一个巨大的蛋白质家族,在序列上非常相似,因此很难用标准抗体来区分。通过将n -钙粘蛋白融合到smFPs中,Looger团队能够特异性地标记神经元中的n -钙粘蛋白,并表明smFPs融合比融合到3个或更多HA标签提供更好的标记。

4.高分辨率显微镜

如上所述,smFPs可以与传统的显微镜一起使用,如荧光显微镜或共聚焦显微镜,但它们也可以与最先进的成像技术一起使用,如阵列断层扫描、超分辨率风暴成像和电子显微镜。这些技术的样品制备有时使使用抗体检测蛋白质标签变得更加困难。相比之下,smFPs有许多表位,在样品制备后,smFPs比GFP等标准蛋白标签更好地保留了被检测的能力。特别是对于STORM, smFPs提供的高强度信号可以产生更好的分辨率的图像。

结论

通过结合FPs和表位标记的优点,smFPs似乎是非常有效的探针,可以精细地显示亚细胞结构或低丰度蛋白。当使用AAV时,这些探针可以用来标记通常难以看到的神经元回路和结构。smFPs是神经科学家研究大脑的工具包的一个优秀的附加组件,我们期待smFPs在未来的扩大使用。


参考文献

1.维斯瓦纳坦,萨拉达等人。“光学和电子显微镜的高性能探针。”自然方法12.6(2015): 568。PubMedPMID: 25915120。pmed中央PMCID: PMC4573404

2.牧羊人。(2004)。在 ”大脑的突触组织“。牛津大学出版社,纽约。第719页。

3.Rizzo,Mark A.,Michael W. Davidson和David W. Piston。“荧光蛋白跟踪和检测:荧光蛋白质结构和颜色变种。”冷泉港协议2009.12 (2009): pdb-top63。PubMedPMID:20150100

4.沙纳、内森、乔治·h·帕特森和迈克尔·w·戴维森。"荧光蛋白技术的进展"细胞科学杂志120.24(2007): 4247 - 4260。PubMedPMID: 18057027

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