新神经科学工具:SF-Iglusnfr谷氨酸传感器

泰勒福特

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iGluSnFr荧光与谷氨酸输入和测量神经元通信在之前的一篇博客文章中,我们讨论了如何使用荧光蛋白来构建vwin德赢娱乐平台生物传感器,监测过程或检测分子的生物工具。在这里,我们将潜入SF-IGLUSNFR的细节,最近升级的生物传感器旨在检测谷氨酸。

iGluSnFr的起源

Iglusnfr含有谷氨酸结合的荧光荧光iGluSnFr于2013年由Loren Looger的实验室给研究人员能够从神经元和其他脑细胞中监测谷氨酸释放的能力在活的有机体内。谷氨酸在突触通信中起各种作用,可以触发其他形式的神经元信号传导和调节。

为了创建IGLUSNFR,LoOGer Lab楔入的GFP在细菌衍生的周质谷氨酸结合蛋白的两半之间称为GLTI。当所得融合蛋白与谷氨酸结合时,构象变化导致来自插入的GFP的荧光强度的增加。

在表征Iglusnfr.在体外该研究显示,iGluSnFr可以被谷氨酸选择性激活,并对其进行调整以提高其反应性。Looger实验室表明,iGluSnFr可以检测谷氨酸中的神经元活动C. Elegans.,斑马鱼和老鼠。

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升级iGluSnFr

尽管这是一个有用的工具,但对于需要高信噪比或高频率谷氨酸信号事件成像的实验来说,第一个版本的iGluSnFr不是最佳的。因此Looger实验室在3个主要方面对iGluSnFr进行了改进在这里。研究人员做了以下工作:

  1. 增加了Iglusnfr的亮度
  2. 创建具有不同谷氨酸结合动力学的新的iGluSnFr变体
  3. 创建了蓝色和黄色的iGluSnFr变体

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增加亮度

在他们的第一次改变到IGLUSNFR,Marvin等人交换了EGFP,用于SFGFP以创建SF-IGLUSNFR。这种改进的变体具有细菌中具有更高的表达水平,并且最终在对小鼠和雪貂模型中感测谷氨酸时产生更强的荧光信号。

通过各种谷氨酸结合动力学增加多功能性

Iglusnfr变体的谷氨酸滴定虽然原始Iglusnfr在细胞培养物中具有生理相关的4μm的4μm亲和力,但这种相对较低的亲和力水平影响的性能在以下设置中:

  1. 实验设置需要低频信号检测,增加亲和力和高信号到噪声比

  2. 识别离散,高频事件 - 这些需要更低的亲和力(通过更快的OFF率)来识别各个事件的信号

为了克服这些问题,Marvin等突变了已知为亲和力至关重要的Iglusnfr融合蛋白的区域。这种所谓的“铰链区”的突变导致识别两个有用的变体:

  • sf-iglusnfr.a184s.(对谷氨酸的亲和力增加)
  • SF-IGLUSNFR.S72A(降低对谷氨酸的亲和力)

Marvin等人。进一步表明,与IGLUSNFR相比,A184S变体响应于较低浓度的谷氨酸产生更强烈的荧光信号。另一方面,S72A变体更好地检测在电刺激时神经元谷氨酸释放等重复的高频事件。通过这些变体,研究人员可以选择最适合其实验需求的具体工具。

新的SF-IGLUSNFR颜色

最初的iGluSnFr只有一种颜色——绿色。研究人员可能需要更多的颜色来成像附近细胞的单独信号事件,或者容易识别特定细胞类型的谷氨酸信号。因此,Marvin等人交换了iGluSnFr中的GFP发色团,并优化了glti荧光蛋白连接,以产生蓝色(sf - azurire -iGluSnFr)和黄色(SF-Venus-iGluSnFr)变体。事实上,除了增加新的颜色,黄色的变种也可以用便宜的1030nm双光子飞秒激光成像,可以在一个样本中激发多个区域。有了这些SF-iGluSnFr结构,科学家们就有了新的iGluSnFr颜色和新的刺激方式!

在实验室中使用SF-iGluSnFr

新的SF-iGluSnFr变体应该能让科学家们强有力地检测大脑内外的信号事件。在本文讨论的论文中,Looger实验室专注于SF-iGluSnFr在神经生物学中的应用,但是,正如他们在2013年的工作中提到的,谷氨酸信号在很多情况下都存在,并且可能对研究细菌、动物和植物等生物体的科学家有用。

SF-iGluSnFr变体进来AAV.载体可从addgene提供。Looger Lab提供了可以用于表达SF-IGLUSNFR变体的启动子系统的简要分解:

    • CAG:通用强大的推动者。制定为AAV-DJ进行神经元表达。
    • CAG-FLEX:CAG启动子,弯曲在CRE表达细胞中表达。
    • Hsynap:人类Synapsin-1启动子。适合神经元表达。
    • hSynap-FLEX: Synanpsin-1启动子,在表达crea的细胞中表达。
    • GFAP:胶质纤维酸性蛋白(启动子)。有利于胶质细胞表达(不是神经元)。

我们很高兴看到你如何使用这些伟大的新工具!

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参考文献

1。Marvin, Jonathan S.等。谷氨酸传感器iGluSnFR的稳定性、亲和性和色度变异自然方法(2018): 936 - 939。PubMedPMID:30377363

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2。Marvin, Jonathan S.等。“优化的荧光探针,用于可视化谷氨酸神经递质。”自然方法10.2(2013):162。PUBMEDPMID:23314171。pmed中央PMCID: PMC4469972

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