Optimetics + Crispr,使用光来控制基因组编辑

Caroline Lamanna.

最初发布于2016年3月8日,最后更新了9月3日,2020年9月3日尼瑙奈曼。

自2012年的基因组工程初始应用以来,世界各地的科学家一直对CRISPR技术进行了重大改进。其中许多进展源于减少偏离目标CAS9活动的目标。使用凝血酶,素编辑,抗CRISPR蛋白和其他技术均旨在改善靶向特异性或降低CAS9活性的持续时间。

致光学领域以实现精确的时间和空间控制而闻名。Optimetics.使用遗传编码的工具,例如微生物OPSINS,使用光控制蜂窝活动。2015年,科学家合并了CRISPR和致光学技术,开发各种可光激活的CRISPR工具。这些工具允许科学家使用光来从外部控制基因组编辑过程的位置,时序和可逆性。继续阅读,了解研究人员可用的各种光控制的CRISPR工具 - 在Addgene中容易发现。

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使用DCAS9闪耀着转录激活的光线

首先发布的初始可光激活的CRISPR系统于2015年初,专注于使用光来控制转录。两个单独的实验室,莫里斯科佐藤的实验室在东京大学查尔斯Gersbach的实验室在杜克大学基于光诱导的异二聚化密钥化2(Cry2)和钙和整合蛋白结合蛋白1(CIB1)蛋白质开发的类似系统。两组的目标是创建一个系统,该系统将在赋予SP的同时使用光线开启和关闭基因表达AtiTemporal控制,可逆性和可重复性。

SATA实验室开发的系统由两个融合蛋白组成:1)基因组锚 - 融合到CIB1的无活性,死亡Cas9蛋白(DCAS9);2)活化剂 - 与转录活化剂结构域(VP64或P65)融合的Cry2光解酶同源区域(Cry2phr)。在表达细胞后,DCAS9-CIB1融合与由引导RNA(GRNA)的指示结合到靶DNA序列,而Cry2Phr-Activator融合漂浮在下图中描绘的。一旦被蓝光触发,Cry2和Cib1蛋白质异二聚体并将活化剂移入到位以激活基因转录。研究人员测试了各种组合以优化融合蛋白。最佳性能组合是NLS-DCAS9-TRCIB1和NLSX3-CRYPHR-P65 - 它在31倍的暗状态下具有最低的背景活动和最高折叠诱导。通过在蓝光曝光(470nm)期间使用狭缝图案,研究人员表明,人ASCL1基因的表达可以以可逆和可重复的方式在空间上控制。

和他们的光激活CRISPR / CAS9效应器(鞋带)系统,Gersbach实验室利用类似的策略来开发优化的光活化CRISPR基因激活系统,但在不同的最佳融合蛋白组合上稳定。优化的蕾丝系统包括:1)CIBN-DCAS9-CIBN,其中CIBN是CIB1的N-末端片段,它与DCAS9的N-和C-TEMINI融合;2)Cry2FL-VP64,全长Cry2的融合和转录激活域VP64。在HEK293T细胞中使用该系统诱导人IL1RN的表达,研究人员在2小时后的mRNA水平增加11倍,30小时后增加400倍。当蓝光(450nm)循环接通时,该系统也被认为是可逆的并且可重复的。使用狭缝光掩模,研究人员还证明了在空间上控制基因表达的能力。

这两种技术都利用了光诱导的二聚化来激活它们的CRISPR系统。这种常见的致敏技术可用于其他分裂系统,其中需要重新酶活性。

使用分割系统的NHEJ和HDR由NHEJ和HDR的可光激活基因组修改

2015年后,佐藤实验室推出了一个可光激活的系统切割靶DNA序列(Nihongaki等,2015)导致双股突破(DSB)可以通过非同源终端连接(NHEJ.)或同源性定向修复(HDR.)。该系统是独一无二的,因为它利用“分裂”核酸酶 - 作者分段的Cas9进入N-末端(残基2-713,N713)和C末端(残留物714-1368,C714)半部,使Cas9非功能性当拆分但重新分配一半时恢复功能。作者通过融合光融合,杂于Cas9碎片的每个Cas9碎片,如下图所示。他们最成功的设计利用磁铁照片开启蛋白质来自真菌感光体,生动(VVD,N.Crassa)(Kawano等,2015)。绰号Pacas9-1并由融合蛋白N713-PMAG和NMAGHIGH1-C714组成,这种新系统既有低背景和高折叠诱导CAS9活性(16.4倍)。该PACAS9-1光诱导系统能够识别相同的PAM,并具有与全长CAS9(FLCAS9)相似的靶向特异性。当由蓝光(470nm)引发时,PACAS9-1通过NHEJ(频率为20.5%)诱导诱导突变,并通过HDR诱导修饰(频率为7.2%)。

作者另外表明,它们可以通过使用NMAGC714而不是NMAGHIGH1-C714来改变PACAS9-1来降低系统的背景活动。这种变化没有显着改变系统EM在用光和降低的背景DSB激活时产生突变的效率(未检测到的)。像他们的前勤工作一样,Sato实验室还表明Pacas9-2系统可以通过打开和关闭蓝光来空间控制和可逆地激活。

因为人们可能期望Cas9,Nihongaki等人的模块化。表明,可以在分裂融合中交换Cas9域并产生可光激活的尼斯和一个可光激活的压制者(DCAS9)。所有变体的活动是可逆和可重复的。

分体上的致光学系统用蓝光激活Crisprp活动

由于2015年发布的这些初步研究,已经开发了更多的分裂系统,用于与基于CRISPR的基因编辑一起使用(见下表)。例如,远红光激活拆分 - CAS9(快速)系统组成型表达CAS9的C末端片段,同时N-末端的转录是光依赖性的(Yu等,2020)。为了表达N-Cas9,海丰叶氏实验室使用了响应于远红光(730nm)的细菌植物植物Bphs,其产生C-Di-GMP。该核苷酸触发蛋白质BLDD对核的易位。为了将这种轻依赖性活动耦合到转录,它们将BLDD融合到转录激活剂P65和VP64,其又转录N-Cas9。然后,N-和C-CAS9片段分别以分别与高亲和力相互作用蛋白COH2和DOCS融合而形成官能蛋白。

自蓝光在体内有限的应用中,使用远红光的使用特别令人兴趣。紫外线和蓝光易于被皮肤吸收和散射,因此无法达到更深的组织。另外,高强度暴露会导致DNA损伤。然而,远红光可以穿过皮肤表面5毫米,并且较少的光毒性。使用快速系统,YE的实验室可以使用编码快速构建体的Minicircle DNA载体编辑小鼠中的TDTomato荧光报告基因。该概念验证模型打开了在动物模型中基于CRISPR的系统的致敏性操纵的诱人可能性。

使用防克隆来关闭基因组编辑

单链Cas9 Photoswitches

CAS9的光激活也可以使用单链融合蛋白来实现通过将CAS9融合到光感受器来实现。一个主要例子来自实验室迈克尔林,谁开发了一个由Cas9和光可解离二聚体绿色荧光蛋白组成的嵌合蛋白(PDDRONPA)(周等人,2018年)。Pddronpa二聚体响应青色光(500nm)而解散。通过将两个pddronpa结构域融合到侧翼的基点,荧光结构域在黑暗中二聚化并防止DNA结合。在光线刺激后,PDDRONPA部分分开,允许DNA结合和切割。该技术被应用于创建Photoswoxable SPCAS9,DCAS9和S.UUREUS CAS9(SACAS9)蛋白质,显示这种方法的多功能性。该研究产生了第一光学活性Saca9蛋白。

单链光活性Cas9与青色光有效

stop!光活性防CRISPRS HALT CAS9活动

抗CRISPR蛋白是一种高度多样化的蛋白质,能够阻止CRISPR-CAS系统。它们已被用于阻断基因组编辑,减少离药活性,并防止细胞毒性效应。有关更详细的审查,请查看我们的博客文章:防克隆蛋白关闭CRISPR-CAS系统

听取防克里普尔播客段


只需表达抗CRISPR蛋白的抗粘性蛋白在CAS9活动被阻止时没有提供了很大的控制。因此,共同化的光学技术允许对Cas9活性进行更高的精度和控制。Dominik Niopek的实验室这是通过将抗克切者ACR蛋白,ACRIIA4融合到光敏LOV2域来自A. Sativa(Bubeck等,2018)。Lov2有一个C终端螺旋,在蓝光刺激时展开。当融合到Acria4的催化部位时,这种展开构象变化可能会干扰活性。通过acria4的新型致敏变体,将所得系统造成Crisp-Cas9活性切换(卡萨诺瓦)。如下图所示,在没有光的情况下,CAS9受Acria4的结合并呈现不活动。在蓝光存在下,acriia4被展开的爱情抑制,允许释放Cas9。

不值得注意的Casanova系统的应用是它的使用光介质的Crispr贴标,以研究染色质建筑(霍夫曼等,2020)。荧光DCAS9蛋白可用于鉴定用于成像技术的特定基因组基因座。由于DCAS9的表达可以潜在地改变基因组和染色质架构,因此调节发生DCAS9结合的时间是有用的。Bubeck等人。在U2OS细胞中表达了一种端粒靶向GRNA和具有三个红色荧光标签的DCAS9融合蛋白。在光激活后,DCAS9在分钟内释放,在后面的20-40分钟内形成的红色焦点。Casanova系统是通用的,因为它可以适用于调节基因编辑,打开转录,标签染色质和研究动力学。

光活化的抗克隆蛋白与蓝光有效

使用化学对复印机克切

上述技术各自采用了肌肤的光活性策略另一方面,从天然存在的光活性蛋白(即Cry2和Vivid) - 亚历山大Doiters'实验室采用了不同的方法。这些研究人员使用了遗传编码复印技术插入可轻默的保护组,特别是a硝基苄基复印赖氨酸(PCK),在Cas9蛋白上Hemphill等人。,2015)。为了将PCK插入CAS9上的特定站点,该组使用了一个工程化吡咯唑酯TRNA / TRNA合成酶对它将在到达琥珀色终止密码子标记时添加PCK。(使用Pyrrolysl TRNA合成酶来了解有关特异性特异性氨基酸的特异性掺入,阅读这篇文章)。

该组首次测试CAS9中的各种赖氨酸,以确定哪种最佳丧失蛋白质裂解靶向DNA的能力,如下图所示,沉淀在光刻K866赖氨酸上。接下来,通过使用双重记者荧光测定,Hemphill等人。证明Cas9k866pck突变体在用UV光(365nm)照射之前确实无活​​性,并且紫外线暴露于其显示与野生型Cas9相似的切割活性。还示出了这种光刻技术在使用光掩模技术时赋予Cas9切割的空间控制。最后,Hemphill等人。呈现的数据显示,这种遗传编码的复印Cas9系统可以沉默内源基因表达 - 在HeLa细胞中证明光诱导的转移素受体CD71的沉默。

光盘化学品从Cas9释放,用UV光。然后Cas9变得活跃

可比较的光激活CRISPR策略

出版物 系统昵称 可光激活部分 Cas9 Variatn. CRISPR蛋白质应用
分配系统/光引起的二聚化
nihongaki等。,2015年 Cry2和A来自A. Thaliana的Cib1 DCAS9. 基因转录的激活
Polstein等人。,2015年 蕾丝 Cry2和A来自A. Thaliana的Cib1 DCAS9. 基因转录的激活
nihongaki等。,2015年 Pacas9. 来自N. Crassa的磁蛋白 拆分CAS9,拆分CAS9 Nickase,分开DCAS9 NHEJ和HDR的基因组编辑,Crispri抑制基因表达
nihongaki等。,2017年 分裂CPTS2.0. Cry2和A来自A. Thaliana的Cib1 DCAS9. 基因转录的激活
Kim等人。,2019年 Ladl. Cry2和A来自A. Thaliana的Cib1 DCAS9. 激活基因转录。标签基因组基因座。改变染色质架构。
yu等,2020年 快速地 来自R. Sphaeroides的BPHS 拆分Cas9. NHEJ和HDR的基因组编辑。可用于体内型号
单链光学性能Cas9
Richter等人。,2016年 TSRC9. Rslov来自R. Sphaeroides Cas9,DCAS9. 基因编辑
周等人。,2018年 pddronpa. Cas9,DCAS9. 基因编辑,转录
轻依赖性防克隆
Bubeck等,2018年 卡萨诺瓦 来自A. Sativa的Lov2 Acria4抗CRISPR蛋白,与CAS9或DCAS9共同表达 抑制基因编辑和转录。标签基因组基因座
光化学控制
Hemphill等人。,2015年 硝基苄基赖氨酸 Cas9 K866PCK突变体 NHEJ和HDR的基因组编辑
Jain等人。,2016年 Crispr-Plus. 光纤维可爱的SSDNA寡核苷酸 CAS9,复印GRNA 基因编辑
Manna等人。,2019年 NPPoc-Conged Trimethokim(TMP) Cas9融合到破坏稳定的域名(Cas9-DHFR) 基因编辑,转录
周等人。,2020年 NPOM笼核碱基 CAS9,复印GRNA 基因编辑

有关详细信息,请查看此信息综合评论比较致敏CRISPR技术(Matony等,2020)。无论您是否正在寻求激活,压制或修改基因,您现在可以使用您使用的工具来控制使用光的基因组编辑。我们期待更多的工具作为CRISPR和Optogenetics继续发展,迫不及待地想看到您将来使用这些的很酷的应用程序!


参考

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