而慢病毒载体vwin668是受欢迎的基因交付工具，生产慢病毒，可以构成某些挑战。是否选择一个最适合实验的系统，试图产生可用的病毒滴度或者在目标细胞系中的微调选择和表达，研究人员经常发现自己面临着障碍。在这篇文章中，我们将概述与生产和使用Lentivirus相关的一些共同挑战，并为克服这些障碍提供一些提示和技巧。
说话'回合我的（慢动力）一代
通过Lentivirus递送基因的第一步是决定特定实验最适合的包装系统。较新一代的慢病毒包装系统旨在防止复制竞争力的慢病毒（RCL）。复制能力可能来自病毒生产过程中的重组事件，对用户带来生物安全风险。为了降低此类事件的风险，新的慢病毒包装系统将病毒元素分为多个质粒。第二代包装系统使用3质粒;通常编码VSV-G的包膜质粒，含有含有结构基因的包装质粒和携带转移基因的转移质粒。通过将病毒元素除以多种质粒，重组的风险和因此，大大减少了RCL的产生。第三代包装系统通过从包装质粒中除去病毒Rev基因并将其掺入第四质粒来进一步分割病毒基因组。另外，5'长末端重复（LTR）的启动子在第三代系统中突变，使得它不再需要病毒反辐期剂TAT。有关不同几代慢病毒包装系统的更多信息，请参阅addgene's慢动力指南。
虽然第三代包装系统提供额外的安全性，但它们也需要第四个质粒。额外DNA的要求可以影响包装细胞系的转染效率，从而影响病毒的滴度。另外的质粒也会影响实验优化。在开始实验之前，建议您尝试几种不同的转移，包膜和包装质粒的比例，以获得最佳滴度。需要另外的转染质粒可以使这些优化实验更具挑战性。考虑到这些考虑，当规划实验用户时，应该权衡增强的生物安全的益处与潜在的击中;在选择正确的系统时，应全部考虑最终用户的BL2的体验，转基因的大小和下游应用程序。
最近，A第四代封装系统已通过Clontech获得。该系统通过将病毒基因组除以另外的质粒来提高安全性，从而增加产生RCl所需的重组事件的数量。为了克服第三代包装系统的滴定障碍，该系统包含TET-OFF转录激活系统，以推动高水平的某些病毒组分的表达;根据制造商，这些变化导致高达25倍高的产量高于其他可用系统。
生产Lentivirus：这是关于T的（转染和滴度）
为了生产慢病毒，将编码结构元素，包膜和转移基因的质粒转染到包装细胞系中，通常是293t的衍生物。将包装细胞孵育，在几天后，收集上清液，过滤并滴定。获得可用的慢病毒的主要障碍是为您的实验产生足够高的浓度或滴度。改善滴度，首先优化转染条件。如上所述，可以调节质粒比以增强滴度。此外，转染方法（即聚乙基亚胺，磷酸钙或脂质体方法），反应的体积，以及收获的时序和数量都会影响滴度。重要的是，一个转移质粒的优化条件并不总是最适合他人。例如，在我们手中，我们发现48和72h的双重收获方法产生高滴度病毒，用于用小插入物（如CRISPR导向器）转移质粒（例如CRISPR导向器），而单个72h收获是最适合Cas9的较大基因。有关转染比率如何影响转染效率的示例，请参见图1。
对于一些转基因，转染优化根本不足以获得足够的滴度;这通常是大基因的情况。这是由于大刀片的低效包装;一项研究由Kumar等人。发现在某些情况下，滴度可以滴加10倍，每2kb增加插入尺寸。为了克服这一点，慢病毒可以集中通过多种方法，例如超速离心，离心蔗糖梯度，旋转柱和聚乙二醇（PEG）沉淀。所有这些方法最终将病毒颗粒分离出允许您以较小的体积集中的病毒颗粒。因此，您最终将比较低的储备率相当较低。例如，在addgene中，我们通常集中100倍，意味着10厘米2与从未浓缩的制剂中收集的15毫升相比，培养皿制备的病毒只能得到150 μl的物质。
考虑到这一点，如果实验需要一定量的病毒，请考虑通过增加10厘米的数量来缩放2菜肴或增加血管尺寸。选择更大的容器，例如3或5层瓶将需要一些初始优化;在开始之前，需要优化细胞数，介质体积和质粒浓度。我们建议计算较大容器的表面积与10厘米的比率2相应的盘和调节细胞数，质粒浓度和实验体积。虽然您可能需要进行一些最终调整，但这通常是一个良好的开始。如果您未预期常规需要大量的Lentivirus，您可以选择仅增加10厘米的数量2菜肴。虽然这个选项很有吸引力，因为单个10厘米的过程相同2菜肴可以很容易地应用于多个菜肴，请记住，处理多个菜肴将花更长时间，可能会增加错误或污染的风险。
最后，浓缩方法的选择取决于各种因素，例如可用资源，成本和下游应用。例如，虽然PEG沉淀方法相对便宜并且不需要超速纤维，但PEG将在溶液中沉淀所有蛋白质，而不仅仅是慢病毒;因此，当下游需要纯病毒时，这可能不是最好的方法。
评估慢病毒滴度时，不要将苹果与橙子进行比较
在选择包装系统和生产慢病毒后，是时候滴度。当测定慢病毒滴度时，一个重要的考虑因素是用于滴度的细胞系。通常，研究人员会选择一个相对宽松的细胞系进行滴度，以获得最佳滴度。虽然这一信息提供了一个很好的起点，但它可能无法转化为目标细胞系。为了克服这个问题，我们建议在转导靶细胞系时使用一系列剂量的慢病毒。人们还应该考虑滴度转导实验的细节。培养基选择、反应容器、病毒剂量、体积和转导时间都将影响所记录的效价，在转导靶细胞系时应予以考虑。有关慢病毒滴度的更多提示，请参阅我们的博客。
在选择最好的慢病毒系统之间，产生可接受的滴度的病毒，并成功地转换了很多感兴趣的细胞系会出错。我们希望我们为您提供了一些想法，以考虑您是否遇到了障碍并鼓励您查看慢动动力协议和博客文章在Addgene的网站上用于额外资源。
参考文献
关键词:慢病毒载体;包装极限;vwin668胡志明。2001年10月12日。北京:北京大学出版社。PubMed.PMID: 11589831。
江W.等。Al ..一种优化的高滴度慢病毒制剂的方法，无需超速离心。SCI REP。2015;5：13875。PubMed.PMID：26348152.。pmed中央PMCID：PMC4562269。
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