这篇文章由麻省总医院的博士后Kusumika (Kushi) Mukherjee贡献。
十多年前实验:和同事们报道，通过添加诱导多能干细胞(iPSCs)可以将分化细胞重编程为诱导多能干细胞(iPSCs)重编程(或“山中”)因素他们改变了再生医学的面貌。他们的工作为诱导多能干细胞的临床和治疗应用开辟了广阔的可能性。人类诱导多能干细胞(hiPSCs)的产生现在为开发和使用患者特异性体细胞提供了一个机会，否则很难获得。这些可以用来进行细胞治疗和疾病模型在体外。
从成纤维细胞和角质形成细胞到外周血单个核细胞(PBMCs)，成人体细胞的许多来源已经被探索其在诱导多能干细胞编程中的适用性。从全血中分离的pbmc对诱导多能干细胞的产生有许多好处:
- 与收集成纤维细胞的过程相比，从病人身上抽取血液更容易，也更常规，而收集成纤维细胞则需要更有侵入性的皮肤活检程序。当招募患者，特别是儿童和患有皮肤病的患者进行研究和临床试验时，这将成为一个主要的好处，因为它允许获得更多的自愿参与者。
- 虽然从老年患者中获得的成纤维细胞的重编程效率较低，但在获得血液的患者的年龄和随后的重编程成功之间没有发现这种相关性[1]。
- 成纤维细胞需要培养和扩大在体外对于几个段段来生产足够数量的开始细胞进行重新编程，而在收集后立即收集的PBMC被重新编程[2]。
- PBMCS显示比年龄匹配的成纤维细胞更接近HIPSC的独特表观遗传签名[3.]。
这些优点使pbmc成为重编程的理想体细胞来源。在这篇文章中，我将描述一种episomal载体系统，通过表达针对p53的shRNA，一种修饰的重编程因子鸡尾酒和病毒蛋白EBNA-1来提高重编程效率。
从pbmc中重新编程hiPSCs的方法
虽然重编程方法的选择往往取决于体细胞的来源，但所有重编程方法的共同目标是重编程因子OCT3/4、SOX2、KLF4和C-MYC[1]的表达。对于临床级hiPSCs的衍生，不需要通过整合病毒载体修饰原始基因组的重编程方法是首选。vwin668这是为了避免插入突变的机会，插入突变是指转基因整合到基因组中，导致插入位点的功能基因被破坏，从而潜在地促进肿瘤发生在活的有机体内。这种现象在过去的基因治疗试验中有记录，在临床领域仍然是一个安全问题[4]。在为临床目的生成hiPSCs时，需要考虑三种主要的重编程方法:
- mRNA转染 - 这允许重编程因素的瞬时表达
- 仙台病毒一种非整合RNA病毒
- 重组载体 - 面粒体瘤性维持表达重编程因素的DNA质粒
到目前为止，mRNA转染的方法还没有成功地从PBMCs中获得诱导多能干细胞。大多数实验室使用仙台病毒有效地重新编程pmcs [5]。然而，仙台病毒方法是昂贵的，特别是在用于制作临床等级的HIPSC。例如，CytoTune™-iPS 2.1仙台重编程试剂盒该产品在ThermoFisher Scientific的售价为1.1万美元，可用于6-8次重编程反应。使用仙台病毒的另一个缺点是残留病毒物质的持久性[6]。完全清除残留的病毒颗粒并建立无病毒的hiPSCs通常需要5-10代。此外，与仙台病毒合作需要严格的生物安全措施，从而增加了程序的成本。Episomal重编程是创建临床级、安全、非病毒和非整合hiPSCs的理想和经济有效的方法，其中编码重编程因子的载体在靶细胞的细胞核中作为单独的染色体外元素。该方法还减少了仙台病毒生产和使用过程中涉及的生物安全问题。
带有episomal向量的pmcs的重编程效率
蜕皮载体基于Epstein-Barr核抗原-1（ORIP-EBNA-1）系统，其中每个载体含有DNA复制，ORIP和EBNA-1序列的病毒来源，其编码DNA结合蛋白EBNA-1 [7]。这两个序列对于载体在人类细胞中的保留和复制是必要和充分的[8]。EBNA-1蛋白质识别orip并在宿主细胞中同时诱导血吸虫的扩增。这使得重新编程因素的相对高度和长期的表达。然而，通过重组载体重新编程PBMCs的嗜患者的低效率（0.001-0.03％）[3，9]。2011年，Chou等人生成了一个包含六个因子-的两个向量的混合物OCT3/4,SOX2,KLF4,原癌基因,LIN28和SV40大T抗原(sv40lt.)。以PBMCs为体细胞来源时，该方法的重编程效率仅为0.001%。这意味着在最佳情况[7]中，每100毫升起始血液样本中只有16个hiPSC菌落。在患者血液样本有限的临床环境中，如此低的重编程效率是使用pmcs作为体细胞来源进行重编程的主要障碍。
增强PBMC重新编程效率：PCXLE eBisomal矢量工具包
以前已经有研究表明，抑制TP53可以像替代一样增强诱导多能干细胞的生成原癌基因与l-myc.(10,11]。虽然在这两个因素存在的情况下促进iPSC生成的机制还不完全清楚，为P53添加shRNA和替换原癌基因与l-myc.在Okita等人的episomal重编程鸡尾酒中，提高了PBMCs[7]的重编程效率。小组生成的pCXLE外泌体载体系统是编码重编程因子的三个外泌体质粒的优化混合物(表1)。episomal载体通过电穿孔导入细胞。电穿孔后10天获得hiPSC集落，大部分集落不整合，核型正常，能够分化为三个胚层[7]的各种细胞类型。
为了进一步提高重编程效率，在重编程鸡尾酒中使用了一个额外的质粒pCXWB-EBNA-1。pCXWB-EBNA-1缺乏oriP，不能在人类细胞中复制，因此暂时表达额外的EBNA-1。短暂表达的EBNA-1增加了其他游离质粒的蛋白表达。当用于pbmc时，pCXLE episomal向量系统将重编程效率从0.001%提高到近0.1%[7]。在hiPSC集合体方面，现在仅从1ml外周血中就可以获得近16个hiPSC集合体，这与之前报道的努力相比是一个巨大的进步。因此，pCXLE episomal系统提供了一种从容易获取的患者血液样本中生成无转基因、无病毒临床级hiPSCs的实用方法。表1中列出的所有pCXLE载体都可以在Addgene上找到。
表1:pCXLE外泌体质粒列表，它们的Addgene ID号和它们编码的重编程因子
| 游离质粒 | Addgene ID＃ | 编码 |
| pCXLE-hSK | 27078 | SOX2和KLF4 |
| PCXLE-HUL. | 27080 | l-myc和lin28 |
| pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | 27077 | OCT3/4和shRNA对抗p53 |
| PCXWB-EBNA1. | 37624 | 瞬态EBNA-1 |
非常感谢我们的客人博主，库斯穆卡（Kushi）Mukherjee。
Kusumika (Kushi) Mukherjee，麻省总医院博士后，研究方向为基因编辑和干细胞。在LinkedIn @上联系她https://www.linkedin.com/in/
参考
1. el Hokayem，Jimmy，Holly N. Cukier，和Derek M. Dykxhoorn。“血液衍生的诱导多能干细胞（IPSC）：福利，挑战和前方的道路。”中国阿尔茨海默病与帕金森主义6.5（2016）。PubMedPMID：27882265。公共医学中心PMCID: PMC5118044。
2.Kim, Y.， et al.，从血细胞中产生人诱导的多能干细胞:一种通过离心连续镀重编程细胞的有效方案。干细胞，2016年。2016：p。1329459. PUBMED.PMID：27579041。公共医学中心PMCID: PMC4989082。
3. Chou，B.K.等人，通过非整合质粒与血细胞的非整合质粒有效，具有独特的表观遗传和基因表达特征的高效人体IPS细胞衍生。2011年Cell Res。21（3）：p。518-29。PubMedPMID: 21243013。公共医学中心PMCID: PMC3193421。
4.hachin - bey - abina, S, et al.， 2例scd - x1基因治疗后lmo2相关克隆T细胞增殖。科学,2003。302.(5644): 415 - 9页。PubMedPMID: 14564000。
5.使用活化的T细胞和仙台病毒的组合，Seki，T.，S. Yuasa和K.Fukuda，从少量人外周血中产生诱导的多能干细胞。Nat Protoc，2012年。7(4): 718 - 28页。PubMedPMID: 22422317。
6.诱导多能干细胞的最新技术更新和临床应用。韩国J Intern Med, 2014。29(5): 547 - 57页。PubMedPMID: 25228828。
7.一种高效的非病毒方法从脐带血和外周血细胞中生成不整合的人诱导多能干细胞。干细胞,2013。31（3）：p。458-66。PubMedPMID：23193063。
8. EHRHARDT，A.等人。，基因治疗的简象载体。Curr基因，2008。8(3): 147 - 61页。PubMedPMID：18537590。
9.使用非整合的episomal载体，从多个供者的血液中提取CD34+细胞，生成诱导多能干细胞。《公共科学图书馆•综合》,2011年版。6(11): p . e27956。PubMedPMID: 22132178。公共医学中心PMCID: PMC3222670。
10.通过p53-p21途径抑制诱导多能干细胞的生成。自然,2009年。460.(7259): 1132 - 5页。PubMedPMID：19668191。公共医学中心PMCID：PMC2917235。
11.中川等，通过转化缺陷的Myc促进直接重编程。美国国家科学研究院，2010。107.(32): 14152 - 7页。PubMedPMID: 20660764。公共医学中心PMCID: PMC2922531。
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