质粒101:复制的起源

由肯德尔摩根

最初发布于2014年2月6日,最后更新了11月10日,2020年11月10日。

现在我们知道所有人抗生素抗性基因,让我们考虑另一个任何质粒的基本元素:Replication / Replicon的起源。复制子由复制的起源组成(ori.)和所有控制元素。这ori.是DNA复制开始的地方,使质粒能够再现,因为它必须在细胞内存活。

质粒的复制品通常与用于复制宿主染色体DNA的那些,但它们仍然依赖于宿主机器来进行额外的副本。ori.序列通常高于和Ts。你为什么问?嗯,A-T碱基对与两个氢键保持在一起,而不是G-C对。结果,富含A-T对的DNA的延伸可以在较低的温度下更容易地分离,并允许复制机械室进入并忙于制作副本。

复制起源的类型

在那里有很多复制起源,因此,为了简单起见,我们忽略了真核细胞和病毒中使用的那些,并且仅关注细菌中的那些。您可能看到的一些常见包括COLE1,PMB1(以稍微不同但众所周知的衍生物),PSC101,R6K和15A。并非所有复制的起源都是平等的。有些人会产生许多质粒副本,其他质粒副本只需几份副本,这取决于它们的监管方式。通常,复制的控制被称为“放松”或“严格“取决于是否是ori.通过RNA或蛋白质积极调节。质粒的拷贝数与阳性和负调节之间的平衡有关,并且可以用复制子中的突变进行操纵。例如,PMB1ori.每种细胞维护大约20份副本,而PUC-这仅不同的两个突变-每个单元格将产生多达700份。

质粒图显示可选标记和抗生素抗性基因以及ori,启动子和插入基因,与插入的基因周围的多钟位点
图1:质粒图显示质粒的标准特征。

那么,你是如何选择的?Addgene高级科学家Marcy Patrick表示,研究人员可以向自己询问一些问题来开始:

  • 质粒是否完全用于大肠杆菌?一般革兰阴性细菌?克果实和克玉米袋?
  • 您是否一次只在您的细胞中键入一个质粒型?
  • 你想做很多你的质粒吗?
  • 基因是否有大量毒性?它总是好的kEEP记住,低至中等拷贝数的质粒仍然可以表达赋予适当的大量蛋白质启动子和生长条件。

明智地选择您的复制起源,避免质粒不相容

换句话说,最好的选择ori.取决于您想要维护多少个质粒副本,您打算使用的主机或托管,以及您是否需要考虑血浆与一种或多种其他质粒的相容性。一般来说,具有相同的质粒ori.不相容因为他们将竞争相同的机器,创造一个不稳定和不可预测的环境。通常,来自同一组的质粒不应转化因此,如果您需要两种实验质粒,请确保他们有“兼容”ori's。有关更多详细信息,请参阅下表。

共同的载体 副本号码+ ori. 不相容组 控制
PUC. 〜500-700. PMB1(衍生物) 一种 轻松
PBR322 〜15-20 PMB1. 一种 轻松
宠物 〜15-20 PBR322 一种 轻松
PGEX. 〜15-20 PBR322 一种 轻松
Pcole1. 〜15-20 COLE1. 一种 轻松
PR6K. 〜15-20 R6K * C 严格
pacyc. 〜10 P15A. B. 轻松
PSC101 〜5 PSC101 C 严格
pbluescript. 〜300-500. COLE1(衍生物)和F1 ** 一种 轻松
PGEM. 〜300-500. PUC和F1 ** 一种 轻松

此表定义了常见的克隆向量,它们的副本号,ori.和不相容的群体。注意A -C兼容性分组是任意指定,来自相同不相容组的质粒不应转化。

+实际拷贝数因而改变。请参阅下面以获取其他注意事项。

*需要PIR基因进行复制(参考)。

** F1是噬菌体衍生的ori.这允许将SSDNA的复制和包装成噬菌体颗粒。具有噬菌体衍生的质粒ori'S.被称为养猪

影响质粒拷贝数的其他因素

虽然序列和调节ori.显着影响质粒的拷贝数,其他外部因素也有贡献。如果您计划净化您的质粒DNA,这些考虑因素特别有用:

插入物

  • 如果含有产生有毒产物的大插入物或基因,细菌往往保持较少的质粒副本。

大肠杆菌拉紧

  • 最多大肠杆菌菌株可用于繁殖质粒,但enda-大肠杆菌最适合高产率的质粒。

生长条件

  • 曝气量,温度,培养体积,抗生素和中等都可以影响拷贝数。一些ori.温度敏感;其他ori.可以“欺骗”扩增更多拷贝,加入氯霉素-确保您的增长条件不适用于您!

文化接种物

  • 新鲜斑纹的细菌有更高的拷贝数-最佳结果总是挑选一个殖民地,不要从甘油股,琼脂刺伤或液体培养中脱培养。
  • 新转化的细胞还给出了从甘油原料中划线的菌落的更高质粒产率。
  • 孵育12-16小时倾向于给予更高的拷贝数,因为细菌刚刚达到固定阶段,但细胞尚未开始死亡。


有什么问题吗?需要澄清的东西?如果是这样,请在评论中发布。此外,请告诉我们您是否对未来的质粒101系列主题有任何特殊要求,并保持关注下一期。

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