质粒101:在addgene的内部NGS质粒质量控制

海森的阿曼达

最初发布2017年8月3日,最后更新了4月6日,2021年By Will Arnold。

2017年介绍NGS对于所有进入质粒,Addgene的巨大变化 - 我们已经使用Sanger测序超过十年的质量控制。现在,感谢赫希姆家庭慷慨捐赠,我们能够采取更大的所有权与内部测序的过程!除了测序质粒,我们还开始使用NGS来检查我们提供的其他服务的质量,包括病毒制剂集中库

作为任何曾经在NGS平台上序列DNA的人会告诉你,虽然该过程变得更加精致和用户友好,但拥有这个过程完全仍然是一个大型企业。优先级第一是为了确保这种转换对我们提供所要求的科学家高质量数据的能力没有影响!

Addgene公司新的内部NGS流程

为了开始,仅通过使用我们的高通量DNA隔离过程,仅通过产生足够量的测序量的高质量分离的DNA样品来实现该过程。该过程以平板形式完成,均在每周两到六个样本的两到六个样品的任何位置。这是我们新进程将开始的地方。与SEQWELL合作,我们正在使用Plexwell技术轻松快速地创建illumina测序库。从开始完成图书馆准备过程只需要一天大约一天,即使是六个板(576个个体质粒)!然后,这些库是QC'D,汇集,并为我们新捐赠的Miseq上的Illumina测序准备。

对于完整质粒测序,我们在MiSeq上进行了2x251次运行,大约需要两天时间完成。运行完成后,我们开始组装过程。再次,感谢我们的合作伙伴在seqWell我们利用一个管道,每个样本的原始数据池和单独组装读取到一个FASTA序列我们QC的科学家可以很容易地分析(见下文为我们寻找在分析质粒序列)。

与Addgene的所有事情一样,这个新过程的每个部分都涉及到大量的质量控制。首先,我们对每个分离的质粒样品进行Picogreen定量,并将其归一化至10倍范围内。不符合这一范围下限的质粒被“失败”,并从培养皿中取出再次制备。然后,这些孔被我们队列中的其他样本填满,比如用于病毒基因组测序(VGS)的病毒样本。质控贯穿于整个文库制备过程,包括Picogreen对各个中间步骤的定量,电泳凝胶的大小,以及最终文库的qPCR定量。

整个质粒的更广阔的视野

为了确定质粒的序列,我们检查了三件事:

  1. 将NGS结果与参考序列比对以确认主干元素。
  2. 通过对齐NCBI入口或使用BLAST来确认基因/插入物。
  3. 确认标签和融合蛋白。

我们将分解以下每个步骤。

调整顺序

当我们对新沉积的质粒进行质量控制时,第一步是将NGS结果与参考序列(如已知的主链序列)进行比对。我们并不一定期望一个完美的匹配-我们经常会在复制的起源或其他共同的主干元素中发现一些不匹配。因为我们已经成功地培养了质粒,为测序做准备,我们相信这几个微小的不匹配通常不会影响质粒的功能。

NGS测序结果显示不匹配

确认插入

我们通常将插入物确认完毕爆炸或通过直接对准NCBI参考序列或由储户提供的序列。存储实验室通常提供插入序列或注释的基因库文件,这些对更复杂的质粒很有用,比如那些包含没有公开参考序列的合成区域的质粒或含有许多修饰基因的质粒。我们寻找可能损害功能的点突变、截断和插入。当我们确实发现突变时,我们检查它们是否会影响翻译的氨基酸。我们也证实了基因的种类与质粒相关的数据相匹配。

使用NGS确认插入物

确认标签和融合蛋白

最后,我们通过使用Snapgene检测共同特征来确认促进剂,标签,融合蛋白和可选择的标记。如果我们发现与押金实验室提供的数据不同的信息,我们会致电这些“质量控制(QC)问题”。然后我们要求存款实验室审查差异。如果存款实验室确认预期这些差异并不影响质粒功能,我们将更新质粒页面的信息。

有时我们会遗漏一个质粒

正如我们在一个人中所说的那样以前的帖子,一些质粒有特别难测序和组装的区域,包括GC丰富和重复的区域。由于这些问题,一些质粒的NGS不会产生一个完整的环状组装。大多数时候,这些质粒作为一个或两个部分组装返回。

我们已经看到了一些质粒元素,这些质粒元素由于其序列而始终难以组装。例如,CAG启动子,由CMV增强剂,鸡β肌动蛋白启动子和兔β-珠蛋白接头受体组成的杂交启动子含有超过80%GC的序列。一些IRES序列还包含GC富含的区域。当我们分析含有这些元素的质粒的NGS结果时,我们将调节受影响的区域并将序列作为线性,部分测序结果。

一个质粒的NGS部分测序

病毒准备和汇总图书馆

除了定期质粒测序外,你们中的许多人将熟悉我们为确保获得高质量、随时可用的病毒制剂和汇集文库所做的努力。

将病毒样品填充成与我们正常完全质粒测序(CPS)工作流程相同的过程,并产生足够的数据以捕获整个病毒基因组。该工作流程及其分析的完整细节可以在这里找到:一种新的下一代测序和分析平台,以评估重组腺相关病毒制剂的身份从病毒DNA提取物

汇总库对NGS的QC有点挑战,因为它们通常与一个库到另一个文库完全不同。它们也与CPS过程不同,因为我们没有完全序列池中的所有质粒,而是选择性地序列池中质粒的可变部分。克里斯特库中的GRNA。一般来说,我们的QC科学家与存款实验室合作,开发适合有关图书馆的PCR策略。我们将订购可以放大图书馆插入的引物。该PCR步骤还为illumina测序和每个样本的独特条形码添加了必要的适配器序列,因此我们可以将测序分配给正确的样本。然后根据需要进行PCR,并使用标准PCR清理试剂盒清除,以除去任何模板DNA和引物。

在对该样本执行广泛的QC后,我们将加载到我们的新MISEQ并设置运行,确保务必记录每个样本的相应条形码。大约24小时后,我们从我们的仪器卸下FASTQ数据并开始分析。我们使用由描述的Python程序的修改版本容等人,2017,我们希望在不久的将来将其作为OpenBio存储库的一部分。呆了!

在Addgene找到质粒!


参考文献

Guerin K,“政府改造”,布尔日D,人我,Haery L, Harten DeMaio K,桑德斯E, Tasissa M, Kostman M, Tillgren M,汉利的马卡拉L,穆勒,Mitsopoulos,风扇M(2020)小说下一代测序和分析平台评估重组腺相关病毒制剂的身份从病毒DNA提取。人类基因治疗31:664-678。https://doi.org/10.1089/hum.2019.277

Joung J,Konermann S,Gootenberg JS,Abudayyeh Oo,Platt RJ,Brigham MD,Sanjana Ne,Zhang F(2017)基因组规模Crisp-Cas9淘汰和转录激活筛选。NAT PROTOC 12:828-863。https://doi.org/10.1038/nprot.2017.016

主题:质粒101,Addgene新闻,质粒

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