质粒101:生物素酰化

由Alyssa Cecchetelli

生物素及其结合伙伴亲和素在分子生物学中广泛应用于各种不同的技术和协议。在这篇文章中,我们将讨论生物素的自然作用,生物素化,生物素-亲和素相互作用的发现,以及生物素化在分子生物学中的应用!

了解细菌融合蛋白的体内生物素化

生物素是生命所必需的维生素

尽管生物素以其在分子生物学中的作用而广为人知,但生物素(维生素H或维生素B7)首先是所有生物体生命所必需的一种必要的辅酶。生物素仅由植物、大多数细菌和一些真菌合成,哺乳动物必须通过外部来源获取维生素。人类从小肠内的微生物菌群中吸收了他们需要的大部分生物素。

生物素是一种辅助因子,以其活性形式共价依附于包括生物素羧化酶和脱羧酶在内的关键代谢酶的活性位点。这些酶催化羧基转移到有机酸,产生重要的细胞代谢物。生物素作为一种化合物到另一种化合物的羧基载体。这些生物素依赖的酶是必不可少的过程,如糖异生,脂肪生成,氨基酸代谢和能量转导。

生物素化是生物素被添加到蛋白质或大分子上的一般过程。生物素可以通过酶法或化学法添加。酶促生物素化在细胞中自然发生,是生物素与新合成酶的活性位点上的特定赖氨酸共价结合的过程。生物素蛋白连接酶(BPL)负责这种高度特异性的翻译后蛋白修饰。大多数生物体在整个蛋白质组中生物素化的酶不到五种。在大肠杆菌例如,底保,BirA,只负责生物素羧基载体蛋白(BCCP)上的整个生物体中的一个赖氨酸的生物素化。

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生物素-亲和素相互作用的发现

生物素和亲和素结合

20世纪30年代末,人们发现,以蛋清为主要食物的动物会出现皮肤损伤和其他严重的健康问题。这种疾病被称为“蛋清损伤”,后来被确定是由于缺乏维生素H,后来改名为维生素B7/生物素。即使这些动物的饮食中添加了生物素,蛋清的损伤也会困扰它们。因此,蛋清中的某些物质隔绝了生物素,使其不能被吸收。在1940年,Esmond E. Snell能够纯化负责结合生物素,亲和素的蛋白质。亲和素很贴切地命名为鸡,“禽”,它是从鸡蛋中纯化出来的。Snell后来通过给大鼠喂食纯化的亲和素(Kresege等人,2004)。亲和素是一种糖蛋白,由四个相同的亚单位组成,每个亚单位可以结合一个生物素分子。

生物素和亲和素彼此有极强的亲和力。实际上,它们之间的键是自然界中发现的最强的非共价蛋白质-配体相互作用之一。一旦键形成,它就不受pH值、温度或有机溶剂的影响。

生物素在分子生物学中的应用

生物素是一种相对较小的水溶性分子,不会干扰它所加入的大分子。生物素也有一个暴露的侧链,可以很容易地操纵以产生活性物种,而不影响亲和素的结合位点。有了这些特征,科学家们开始利用生物素及其与亲和素的强相互作用来进行分子生物学和生物技术研究就不足为奇了。

一旦一种多肽被生物素化(详见下文),它就可以与亲和素或20世纪60年代发现的一种结构相似的蛋白质strepavidin共同表达。生物素-亲和素复合物可以用于和/或操纵科学家的预期目的。生物素化在实验室中最常见的两个用途是蛋白质纯化和免疫沉淀反应实验。生物素化的蛋白质或复合物可以很容易地用涂有亲和素的柱或珠来纯化。

生物素-亲和素相互作用也被用于免疫组化和抗体标记。在这些实验中,生物素被添加到一种或二种抗体中,分别针对你感兴趣的蛋白质或一种抗体。然后将与报告分子结合的亲和素添加到反应中,以便于检测。亲和素上发现的多个生物素结合位点也是这些实验中信号放大的理想选择。在检测过程中,可以在样品中加入与游离亲和素预孵育的生物素化报告酶。这种复合物上任何游离的生物素结合位点都可以结合到生物素化抗体上。这就形成了一个生物素-亲和素复合物的大网络,与你感兴趣的蛋白质结合,导致报告信号的放大和更容易检测。这种策略被称为亲和素-生物素复合物(ABC)免疫组化(IHC)。想了解更多关于ABC和免疫组化的信息,请查看Thermo Fisher Scientific的指南

生物素和亲和素还有一系列其他的分子生物学应用。下面列出了一些其他常见的应用程序,以及相关论文和网页的链接。

  1. 电泳迁移率测定
  2. 酶联免疫吸附法(ELISA)
  3. 南/北印迹
  4. 细胞表面标记
  5. 将多肽附着在底物上
  6. 流式细胞术/荧光活化细胞分选
  7. 原位杂交

生物素化你感兴趣的大分子的方法

为了利用生物素和亲和素的天然结合,重要的大分子首先必须进行生物素化。科学家们已经开发了几种方法来化学化生物素酸大分子在体外在活的有机体内

生物素酰化试剂:

生物素暴露的侧链可以与氨基酸官能团交联在活的有机体内通过特殊的化学试剂(生物素化试剂)。有各种各样的生物素化试剂,它们的功能基团或残基不同,它们的溶解度也不同,因此不同的试剂在不同的微环境中生物素化是有用的。也有可逆和可裂解的生物素化试剂,以帮助特定的洗脱生物素化蛋白。为了帮助确定使用哪种生物素化试剂,请检查Thermo Fisher Scientific的生物素化试剂选择工具。

AviTag BirA:

蛋白质也可以利用特异性生物素化大肠杆菌BPL BirA。如果你还记得,BirA生物素在整个过程中只使一个赖氨酸发生变化大肠杆菌蛋白质组。利用这一知识,科学家们确定了BirA识别和生物素化所需的13个氨基酸序列。这13个氨基酸序列被称为AviTag。使用AviTag,人们可以通过简单地创建一个融合,将AviTag添加到蛋白质的N或C端,从而用生物素标记感兴趣的蛋白质。BirA已被证明可以有效地在细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞中表达AviTag蛋白。看看Kay等人,2009年用于BirA生物素化蛋白的方法。

你可以找到含有这两种物质的质粒AviTagBirA在Addgene !

寡核苷酸标签:

在聚合酶链反应(PCR)中,生物素可以通过生物素化的引物添加到DNA序列的任意一个末端。生物素也可以通过生物素标记的dUTP在PCR过程中被酶结合。有多种类型生物素标记这可以添加到寡核苷酸取决于你的下游应用。生物素标记的寡核苷酸可用于多种应用,包括但不限于原位杂交,印迹(北方和南方)和亲和结合。

Photobiotinylation:

光生物素可用于非选择性标记DNA和RNA。醋酸光生物素由附着于光反应芳酰腙基的生物素分子组成。在强可见光下,芳酰肼基团变得活泼,并与附近的核酸形成连接(McInnes等人,1990)。光生物素化有时比其他酶法更容易,也更便宜。科学家们常用这种方法将蛋白质或多肽附着在固体底物(霍尔登和克里默,2003年)。


参考文献

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