质粒101:CcdB -高效克隆的毒性关键

迈克尔·g·勒米厄(Michael G. Lemieux)著

如果您正在克隆,您可能意识到目前有几种方法可以接近它。这些包括传统的限制性内切酶/ ligase-mediated方法,其发展较晚吉布森组装克隆网关®克隆技术,还有其他一些。每种方法都是独特的,并依赖于克隆反应的关键组件。了解特定的组件是必要的选择正确的克隆方法为您自己的实验,这里我们将集中在一个独特的基因,使流行的网关TM方法:ccdB。但什么是ccdB,它在现代克隆中发挥了什么作用,你为什么要了解更多信息?阅读,了解如何ccdB可以让你的克隆实验简单点。

传统克隆最耗时的方面之一是识别实际上包含感兴趣的插入内容的克隆。简单的说,ccdB通过选择不占用插入的载体,使克隆更容易。但确切地说ccdB完成这一点?让我们从基因的简要历史开始以及分子生物学家如何利用它来发展克隆技术。

CcdB:一种强力毒素…

CCDB PKIL18 / 19质粒图ccdB基因的F性因子质粒E。杆菌,是由CCD操纵子编码的毒素 - 抗毒素系统的一部分,其负责细胞分裂期间的质粒维持。ccdB毒性蛋白质(CcdB)的编码,它充当DNA旋转酶的毒药,用断裂的双链DNA锁定DNA旋转酶,最终导致细胞死亡。ccdA,在CCD操纵子中发现的另一个基因,抗毒素蛋白(CCDA)的代码保护细胞免受毒性CCDB。失去的细胞ccdA通过丧失F质粒,屈服于CCDB的毒性。

…成为一个强大的克隆工具

大约20年前,分子生物学家首次看到了这种系统提高克隆效率的潜力,并开发了利用它的克隆载体。这些被称为pKIL18和pKIL19的载体包含ccdB带有MCS的框架基因。大肠杆菌用空向量进行变换ccdB因此,基因并不能繁殖,因为CCDA无法抵消毒素。然而,如果研究人员将成功地克隆插入载体,则ccdB阅读框会被破坏,使表达重组质粒的细胞得以繁殖。任何包含非重组载体(例如重新连接的空载体)的细胞仍然可以表达ccdB因此会死。该过程显着减少不含重组质粒的克隆数,因此使克隆过程更有效,因为一种不必为插入件彻底筛分菌落。

Gateway®技术(由表达载体TM)基本上是该旧系统的更现代版本,并在单独的帖子中进行详细讨论的优点。专注于ccdB一方面,Gateway利用了同样的原理,即细胞在表达基因时不会繁殖。简而言之,本系统中的“主干”向量包含ccdB。一个成功的插入将完全替换ccdB随着调查员的兴趣插入。因此,更有效地识别肯定的克隆,因为不包含所需插入件的那些不应生长。

ccdB网关克隆

CcdB耐大肠杆菌菌株完成系统

ccdB单独并不是这个系统的唯一关键——我们如何才能使用一个质粒/基因来杀死表达它的细胞?答案在于特殊的品种大肠杆菌可以耐受毒素基因的表达。其中一个是DB3.1,该基因含有一种突变的DNA旋转酶(gyrA462),能够抵抗CcdB的毒性作用。另一种商用的ccdb耐药菌株是ccdB生存™来自Invitrogen.TM。使用DB3.1或CCDB生存TM,可以有效地繁殖和制备含有ccdB基因,然后可以用于下游克隆应用。虽然这两个菌株最终表现相同的功能,但有一些证据表明CCDB Survival™可以更难以转化,这取决于所使用的特定质粒。

We would also like to note that while DB3.1 and ccdB Survival strains have been developed specifically with ccdB-containing vectors in mind, any plasmid that contains the F plasmid (F’ strains) will also be resistant to CcdB, as the native ccdA will be present. Most common cloning strains of大肠杆菌不含F质粒(并被认为是F-);然而,有一些流行的实验室菌株,如NEB稳定,JM109,XL1蓝色或XL10金,即F'。这些菌株可能用于繁殖并制备含CCDB的空骨架,但在选择重组质粒时,不应使用。查看我们的博客帖子常见的实验室大肠杆菌菌株对于更多的应变信息。

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参考

1.伯纳德,P。“CCDB的重组DNA的阳性选择”。生物技术。1996年8月21日(2):320-3。PubMedPMID: 8862819

2.F质粒CcdB杀伤蛋白:CcdB基因突变体,编码非细胞毒性蛋白,保留其调节功能。微生物学杂志。1995年3月15(6):1031-7。PubMedPMID: 7623659

伯纳德,P.等人。“使用F质粒CCDB杀伤基因的阳性选择载体”。基因。1994年10月11日; 148(1):71-4。PubMedPMID: 7926841

伯纳德,P.等。“F质粒CCDB蛋白通过乙酶诱导有效的ATP依赖性DNA裂解。”J Mol Biol。1993年12月5日; 234(3):534-41。PubMedPMID: 8254658

5.F质粒CcdB蛋白杀死细胞涉及dna -拓扑异构酶II复合体中毒。中国生物医学工程学报,1998,22(3):431 - 434。PubMedPMID: 1324324

6.三,我。克莱恩,BC。《f质粒中ccd操纵子的控制》,细菌学杂志1989年5月;171(5):2353-60。PubMedPMID: 2651399。公共医学中心PMCID: PMC209908

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