质粒101:菌落PCR

由Beth Kenkel.

Beth Kenkel.

这篇职位由Iowa大学儿科和儿科部门的研究助理贡献的Guest Blogger Beth Kenkel。如果您对访客博客感兴趣,让我们知道!!

分子克隆需要一些筛查菌落的方法在存在插入物。传统上这已经完成了限制酶消化;然而,殖民地PCR可以在更短的时间内完成同样的事情,并且少钱。菌落PCR的关键步骤是:1)设计引物,用于检测嵌件的存在;2)使用裂解的细菌的上清液设定标准PCR反应(引物,DNTP,聚合酶)作为模板;3)在凝胶上运行PCR产品以分析产品尺寸。此博客文章讨论执行殖民地PCR时需要考虑的一些关键事项。

殖民地PCR概述

设计殖民地PCR引物

殖民地PCR的第一个也许是最重要的步骤是设计底漆。引物设计有3个策略:1)插入特异性引物,2)骨架特异性引物和3)取向特异性引物。

殖民地PCR引物类型

  1. 嵌入式底漆:嵌件特定的引物被设计成以退火到特定的序列。这是一种“是或否”的测试,具有积极的克隆,扩增产物和负克隆,导致没有产品。此外,这种类型的底漆仅告诉您特定插入是否存在,但如果它不是正确的方向,甚至是它在质粒骨架中。

  2. 骨干特异性底漆:第二个选项是设计特定骨干的引物。这些引物设计成向侧翼部位的部位退火。阳性克隆将产生更大的尺寸产品,然后产生没有插入物的负克隆。这种类型的入门对可以告诉您插入件是否是正确的大小以及它是否在骨干内。这种类型的引物对也非常适合筛选用相同骨干板产生的克隆,但包含不同的插入物。当您设计引物以在克隆站点外部退火时,插入件的序列是无关紧要的,允许您使用相同的底漆对屏幕屏蔽许多不同的插入物。下行:这种类型的底漆不提供有关插入件方向的信息。

  3. 定向特异性底漆:如果您需要有关插入方向的信息,那么您可能会考虑设计定向特定的引物。钝端克隆是您可能希望知道插入件的方向的示例。这种类型的引物对的一个成员以侧翼的序列和一个引物退火到插入件中。创建这种类型的引物对的简单方法是混合和匹配的嵌件和背骨特异性引物。

在Addgene找到空骨干

每种方法都具有优点和缺点,如下表所示。您使用的引物类型取决于您的偏好。无论哪种方式,确保在使用它们之前测试菌落PCR引物到筛分菌落。这样做的最佳方法是通过使用您的向量,无需插入物来验证引物是否放大了预期的PCR产品。

底漆设计 凡好 cons
插入特定
  • 简单“是或否”测试结果
  • 没有告诉你插入的方向或插入在质粒中
  • 必须为每个插入制作新的底漆对
特定骨干
  • 提供有关插入尺寸的信息,如果它在质粒中
  • 可用于筛选用相同骨干产生的克隆,因为引物是质粒依赖性的
  • 不提供有关插入方向的信息

或者特定于概述

  • 告诉你插入的方向
  • 告诉你是否存在质粒中的插入物
  • 非常适合钝的结束克隆
  • 您必须为每个刀片制作一个新的底漆对,因为引物依赖于底漆

PCR设置

建立殖民地PCR反应几乎与制备标准PCR反应相同:组合模板,引物,聚合酶和DNTP,然后与标准PCR热循环程序孵育。一个关键差异是质粒DNA必须从细菌中释放以用作PCR模板。处理此问题和一些其他殖民地PCR提示在下面突出显示。

  1. 准备模板:用无菌平坦的牙签或移液管尖端挑选一个殖民地,并以少量的无菌水旋转。挑选3-10个殖民地以进行测试,取决于无连接控制板上的背景落下的数量。背景中越多,您需要屏幕的殖民地就越多。

  2. 为后来的文化储蓄克隆:此时,您将希望挂在克隆上以供以后使用。有几种方法可以做到这一点。如果您要在同一天完成殖民地PCR分析,您可以挽救剩余的细菌 - 水悬浮液并使用它们开始阳性克隆的文化。如果您想存储克隆持续期限,只需将殖民地串起来LB板。您可以使用此板开始液体文化。最后,你可以用你挑选的克隆开始小过夜液体文化,只有迷你准备积极的液体培养。无论您选择哪种方法,确保使用适当的方法选择抗生素

  3. 裂解细菌和设置PCR反应:剩余的细菌 - 水悬浮液将用作PCR反应的模板。您只需要通过在使用前短暂地沸腾样品或通过直接向PCR反应添加小体积的样品来筛选细菌以释放质粒DNA。细菌将在PCR反应的初始加热步骤期间裂解。标准Taq聚合酶足够。

  4. 控制:控制可以制造或打破实验。菌落PCR的最佳控制是相同的,用于验证菌落PCR引物是否首先工作:带有和没有插入物的骨干向量。这些控件是快速参考,当您在凝胶上运行PCR产品时可以使用,以确定菌落是否包含插入件。它们还用作PCR反应的对照。运行没有模板控制PCR反应,用于检测污染也是一个好主意。

在凝胶上分析PCR产品尺寸

菌落PCR琼脂糖凝胶

现在您的PCR完成,是时候在琼脂糖凝胶上运行产品来确定其尺寸。确保使用适当的分子量标准作为参考,并在将它们移液到凝胶上之前将用甘油加入甘油加载染料。以上图总结了先前描述的三个引物的广义预期结果。当使用嵌件特定的引物(1)时,阳性克隆(+)将提供一个带,而负克隆( - )不会。与阴性克隆相比,骨干特异性引物(2)给出阳性克隆(+)的较大尺寸的产物。最后,定向特定的引物(3)给出相同的频带(+)或没有带( - )结果作为嵌件特定的引物,但也告诉您插入件是否具有正确的方向性。

使用Sanger测序验证插入序列

在识别几个正克隆后,最后一步是迷你准备这些克隆并提交质粒进行Sanger测序。测序允许您确认插入件,插入方向和质粒之间的连接序列和插入DNA之间的序列。殖民地PCR将大大减少您需要发送排序所需的克隆数量,但不会告诉您您的产品是否有任何突变。

有很多不同的克隆策略,但无论您最喜欢哪个是您的最爱,菌落PCR是您的分子生物学工具套件中有一个有用的工具。考虑在下次您筛选正克隆时尝试!

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替补席上的提示和技巧

  • 不要挑选太大的殖民地。细菌太多可以抑制您的PCR反应或导致非特异性产品展现在凝胶上。

  • 小心误报。仅仅因为您获得了预期的尺寸PCR产品并不意味着您的插入中没有突变。确保提交多个正克隆,以便在继续进行实验之前验证插入序列。

  • 更短的扩增子趋于更好。较短的扩增子为更短的PCR节目制作,并且更有可能在具有细菌碎片的PCR反应中工作。

  • 使用阳性控制。良好的阳性对照是用相同的骨架质粒转化的细菌。如果此控件不会放大产品,那么您知道PCR设置和/或底漆设计可能存在问题。

  • 使用阴性控制应变。良好的阴性对照菌株是您用于克隆的相同细菌菌株的未转化培养物。这种类型的控制对于嵌件特异性引物尤为重要。如果您的负控制放大了预期大小的产品,您知道细菌的基因组已包含您的目标序列。


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Beth Kenkel.Beth Kenkel目前是爱荷华大学儿科部门的研究助理。她对科学传播和体外诊断特别感兴趣。

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