质粒101:对照质粒

由Chari Cortez.

Chari Cortez.

粉红色的液体移液到组织培养板中科学家每天都有许多不同类型的实验。虽然设计和结果可能有所不同,但在每个实验的一个假设调查中应该存在一件事:适当的控制!

对于每个实验,调查员需要一个标准,可以比较结果;缺乏适当控制的实验结果总是不确定和不可靠的。适当的控件提供了能够正确解释您正在测试的独立变量的正确解释。重要的是,它们展示了实验系统的功能,并有助于确定实验中的故障排除或优化的机会。请继续阅读,了解有关可用于基于质粒实验的各种对照的更多信息。

点击下载addgene的质粒101电子书 什么是对照质粒?

一般来说,控制质粒有助于确保在你的实验中观察到的现象是与你正在测试的自变量特别相关的,而不是其他一些意想不到的因素。使用对照质粒来减少非自变量的任何影响。

为了说明对照质粒的重要性,我们将在摘要中逐步逐步讨论,并遵循基于质粒的实验的实例,描绘其必需的对照质粒,并讨论这些对照质粒对实验的正确设计至关重要。

本实验:基因X表达的敲除Shrna.从质粒中表达

图1:X基因表达水平

与未处理的细胞相比,对表达对基因X的质粒A对基因X的质粒A表达水平没有影响。不过,不用对照质粒治疗细胞。

以上结果来自于一个单独的实验,质粒a(编码人Y骨干基因X的shRNA)被转染到人细胞中。

从这个结果可以简单地得出结论,因为用质粒A处理的细胞中基因X的表达水平类似于未处理细胞中基因X的表达水平 - 但我们可以确定吗?我们是否知道质粒是否成功送入细胞中?shrna目标是否正确?纯化的质粒DNA是否可行?或细胞毒性?事情怎么样?使用适当的对照质粒将解决并回答这些问题。

对照质粒的类型

计划你的实验的一部分,包括确定什么因素需要控制,以消除任何对结果的替代解释。通常,质粒实验采用转染、阴性、阳性和复制对照。

转染控制:空向量和内部控制

转染控制措施转染效率,并能够观察转染本身的任何效果(即转染,转染试剂或转染过程中使用的载体)可能对靶细胞具有。一个转染控制是一个空的矢量控制;具体地,没有独立变量的质粒。回到与图1相关的实验,独立变量是shRNA。因此,空对照载体将是质粒是SANS shRNA,或单独的骨干。空载体控制允许您检查转染试剂或转染过程本身是否对靶细胞具有任何细胞毒性作用。

另一种类型的转染控制是内部对照矢量,其测量转染效率。内部控制可以是组成型表达报告蛋白的质粒(例如,GFP.或者荧光素酶)与试验质粒共转染或转染到细胞的单独孔中。无论如何,报告蛋白活性的量与转染到细胞中的DNA的量和细胞表达蛋白质的能力相关。

在分析图1的结果时,内部控制,例如GFP表达质粒B,可以证明细胞是否成功转染并表达蛋白质。例如,由我们的实验产生的荧光显微镜图像包括上述内部控制并且与图1中的结果一致的实验可以如下所示:

图2:质粒B的表达(作为内部对照)

具有质粒丁质粒B的假设数据,质粒B,内部对照质粒。质粒表达GFP并证明细胞是否成功转染。对于这个假设的实验,细胞不从质粒b表达GFP,因此转染未成功。

该结果表明,由于生命,活细胞的GFP荧光,转染未成功。这个结果介绍了对转染试剂和过程进行故障排除和优化的机会。重要的是要注意,最佳实验条件,包括多少质粒DNA用于任何个人或共转染,应该确定经验。

阴性对照:未处理的细胞,空载体控制和非靶向控制

阴性对照条件和质粒应产生零效果(即,没有观察到任何现象)。在任何基于质粒的实验中,应包括未处理的细胞,因为这些细胞提供了可以比较其他样品的基线/标准。

空载体控制(上面提到的)也可以作为重要的阴性控制。在这种情况下,空载体对照显示载体/骨干本身对靶细胞中基因表达的任何效果。

在使用基因靶向或基因组编辑技术的实验中,如RNAi或CRISPR,非靶向控制可能是适当的,因为它们允许您评估所观察结果的特异性。非目标对照是产生类似产品的阴性对照,但不靶向实验细胞中的内源基因。例如,在上面的实验中,质粒A含有靶向人类基因X的shRNA,并转染人细胞。在该实验中的适当的非靶向控制可能是与质粒A相同的骨架中的shRNA-,其不会靶向任何哺乳动物基因。这种非靶向控制对于对结果的正确解释至关重要,因为它在分析靶向人类基因X的ShRNA的特异性时提供了重要的参考点。非靶向控制还评估了ShRNA一般引入的任何影响靶细胞。

阳性控制

阳性对照质粒应产生预期的现象。前面描述了阳性控制的一个例子,内部对照矢量。一旦您确定您的条件有利于将质粒DNA的成功递送到细胞中,那么内部对照载体就用作转染的阳性对照,因为它产生预期效果,即是绿色荧光细胞(图3)。

图3:质粒B的表达(作为阳性对照)

用阳性对照质粒转染的假设数据。一旦转染条件验光,内部对照载体就用作转染的阳性对照,因为它产生了预期的结果。对于该假设的实验,阳性对照质粒表达GFP。

其他阳性对照是特定于实验的,应该相应地设计。如果你想激活一个基因,你应该设计一个显示最大激活的控件。同样地,如果你试图抑制一个基因,你的控制可能是一个基因表达完全被破坏的系统。这些对照可能基于质粒,也可能不基于质粒,这取决于实验的需要。以我们的实验为例,A质粒中针对人X基因的shRNA的预期结果是X基因表达降低,因此阳性对照应降低X基因的表达。

由于对照质粒的关键特征是最小化实验内非互相变量的效果,因此阳性对照质粒的设计和选择应该是高度特异性的实验和独立变量的询问。

复制控制:技术和生物

可靠的结果可从适当控制的实验中重现。观察到的与自变量相关的表型应随时间和表达自变量的纯化测试质粒的不同制备而一致。有两种类型的复制控制:技术和生物。

通常,技术复制可以被认为是“板控制”。他们不是独立的通常来自一个源。相反,生物复制是独立的可以被认为是“重复性控制”。生物复制是构成样本大小的原因(又名为您的N.价值)“并来自多个独立的来源。我们将描述以下更详细地描述,但参考部分中引用的论文提供了更多的深度信息。

技术复制

技术控制的一个例子是用从同一样品中纯化的质粒转染多个独立孔(在同一个平板内)。复制控制不是测量或评估再现性的独立变量的影响由于纯化质粒,细胞,和媒体中使用的每个井并不是独立的,他们来自相同的源和孵化在相同的板在同一时间。虽然复制控制很重要,但它说明了进行实验的试剂和手的一致性,而不是与自变量相关的观察表型的重现性或一致性。

生物复制

在任何给定的实验中,生物控制都更耗时,最终也更重要。理想情况下,每个生物复制应该使用新鲜的培养基,测试独立的细胞和质粒,在不同的日子进行,等等,但是外部的限制可能会施加一些限制,你应该在解释你的结果时认识到这些。生物控制的关键是独立性:至少你应该在不同的日子里,从开始到结束多次重复整个实验。使用我们上面的例子,我们将在不同的日子里在不同的细胞等分中测试质粒A的不同制备。对与自变量相关的观察表型的重复性和一致性进行生物复制控制,并有助于确保表型不是单一的或与测试质粒的单一制备有关。

现在让我们再来看看我们的实验。在图1中,似乎shRNA并没有敲除基因X的表达,但如图2所示,这可能是由于最初的转染条件。现在我们已经成功转染了我们的细胞(图3),我们可以继续我们的实验,合并额外的阳性和阴性对照,进行多次复制,并最终得到可解释的结果:

图4:基因x的表达水平

假设质粒转染数据。该实验包括额外的正和阴性对照,并具有多个重复。与对照相比,质粒A现在显示了对基因X表达的影响。

设计和选择适当的实验控制不是一件简单的工作,因为生物系统有许多变量。无论设计和执行这些步骤多么令人生畏,适当的控制是负责任的科学探究和调查的基本原则。


参考:

1.神经科学研究中的假期术语问题:它是否影响了您的分析?lazic se。BMC Neurosci。1月14日; 11:5。(2010) PubMedPMID:20074371。公共医学中心PMCID:PMC2817684

2.重复和重复 - 有什么区别,这是重要的?Vaux DL,等等。Embo Rep.。4月;13(4): 291 - 296。(2012)。公共医学中心PMCID:PMC3321166

addgene博客上的资源vwin.com mobile

分享科学刚刚变得更容易...订阅博客

主题:质粒101,质粒

发表评论

分享科学刚刚变得更容易...订阅我们的博客

订阅