质粒101:Cre-lox

作者:A Max Juchheim

CRE-LOX.在我们的质粒101系列之前的文章中,我们检测了一些重要的质粒元素启动子起源的复制蛋白质的标签,抗生素抗性基因(仅举几个)。在本版中,我们将看一下可以使用的非常有趣的工具cre在转基因动物、胚胎干细胞和/或组织特异性细胞类型中特异性、靶向的DNA修饰:Cre-lox重组

Cre-lox是什么?

creo -lox系统是一种可用于诱导特定位点重组事件的技术。该系统由来自P1噬菌体的两种组分组成:CRE重组酶和LOXP识别位点。P1噬菌体使用这些组件作为其天然病毒生命周期的一部分,研究人员适用于用于基因组操纵的组件。

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Cre Refombinase,最初是因为它而命名的CAuses.关于组合”(尽管后来称为“Cyclization关于是一种38 kDa蛋白,负责loxP识别位点的分子内和分子间重组。系统的一个关键优势在于CRE独立于任何其他附带蛋白或共同因子作用,从而允许在各种实验中进行广泛的应用。

loxp(L.调焦O.FX(交叉)有关P.1)位点是34-碱基对长识别序列,其由由8-BP长的不对称核心间隔序列分开的两种13-BP长的回文重复。核心序列中的不对称提供了LOXP现场方向性,而T典型的loxP序列是ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT。除P1噬菌体之外的任何已知的基因组中,LOXP序列不会发生,并且足够长,几乎没有随机发生的几乎没有机会。因此,在DNA序列中的刻意位置插入LOXP位点允许如下所述的非常特异性的操作。

它是如何工作的?

如上所述,Cre重组酶催化两个loxP位点之间的位点特异性重组事件,这两个位点既可以位于相同的DNA上,也可以位于单独的DNA片段上。在一个loxP位点上的两个13bp重复序列被aCRE蛋白质,形成二聚体。然后,两个LOXP位点在平行取向上对齐,允许四种CRE蛋白形成四聚体。在每个loxP位点的核心间隔区发生双链DNA断裂,并将两条链连接起来,导致相互交叉事件。

此活动可以根据LOXP网站的位置和方向具有三个一般性结果:

CRE重组的三个一般结果:反演,删除和易位。

反演:如果loxP位点在同一条DNA链上,且方向相反,则重组产生倒置和DNA区域在LOXP网站之间逆转。

删除:如果两个位点面朝同一方向,loxP位点之间的序列作为一个环状DNA片段被切除(不被保留)。

易位:如果站点位于单独的DNA分子上,则在LOXP站点生成易位事件。

如何使用CRE-LOX?

Cre/lox系统是一个完善的研究工具,特别是在小鼠转基因领域。下面列出了一些最常见的用法。

  • CRE依赖性基因表达-在感兴趣基因上游的loxP位点两侧(通常称为“lox-stop-lox”或“LSL”盒)放置一个终止密码子将阻止基因在无Cre时的表达。在Cre存在时,终止密码子被切除,基因继续表达。泰勒·杰克实验室有一种很受欢迎的质粒:Lox-Stop-Lox威尼斯平底渔船

  • Cre-dependent基因敲除- 相反,将LOXP网站放在基因的两侧(称为“浮动”,“F被淹没液态氧P“),将允许基因表达直至存在CRE,此时基因将被破坏或删除。

  • 选择标记删除-在传统的鼠标瞄准,目标克隆选择使用抗性标记;然而,在最初的选择过程之后,通常需要去除标记。通过浮动选择标记,可以使用Cre轻松地执行此驱逐。

  • 受监管的CRE表达-将Cre置于仅在特定细胞或组织类型中有效的启动子的下游,在特定的发育阶段,或通过使Cre可诱导(如与他莫昔芬或多西环素),Cre重组酶只能在特定的细胞或特定的时间表达。将此与上面描述的一些loxP方法相结合,可以根据实验约束来限制遗传修饰。这已被用于广泛的目的,包括激活致癌基因只在一个特定的器官,或绕过胚胎致命。

为了便于使用CRE-LOX技术,已经构建了转基因小鼠,其在各种无处不在的和调节的启动子下表达CRE,并且还构建了许多含LOXP的等位基因。另外,含Cro-creenovirus(ad-cre)或aav(AAV-pgk-Cre)已被用来成功地将CRE引入感兴趣的细胞。

如果我需要两个单独的重组事件怎么办?

使用LOXP站点的一个电位限制是如果存在两于多个以上,可以严格控制哪些LOXP站点重组;分子内事件具有比分子发生的更大频率,但任何两个网站都可能会重新组合。要考虑此问题,已创建了LOXP站点的备用突变版本,其中包含一个唯一的非对称间隔“NNNTANNN”,其中“N”表示哪些碱基可能与规范序列不同其中包括loxN (GtATACcT)、lox2272 (GgATACtTlox511 (GtATACAT)。这些不同的lox位点与其他相同类型的位点进行重组,但不交叉兼容。使用不同的lox位点变体允许Cre在单个系统中催化多个特定的重组事件。

酿酒酵母FLP-FLP-FRT重组系统是另一个站点定向的重组技术,非常概念性地类似于CRE-LOX,分别与CREPASE(FLP)和短唾液酶识别靶(FRT)位点类似于CRE和LOXP。FLP-FRT技术可以是CRE-LOX的有效替代方案,并且还与其结合使用,允许并行控制两个单独的重组事件。

您是否在研究中使用过CRE-LOX系统?您有任何提示或技巧,还是聪明的CRE依赖技巧?让我们在评论中知道!


参考文献

1.噬菌体P1特异性重组。I. LOXP网站之间的重组。斯特恩伯格和汉密尔顿,1981年。PubMedPMID:6276558

2.噬菌体P1的Cre重组酶在哺乳动物细胞中进行位点特异性DNA重组。绍尔和亨德森,1988。PubMedPMID:2839833。pmed中央PMCID:PMC281709

3.T.转基因小鼠的问题和位点特异性重组。Orban,P.C.,Chui,D.和Marth,J.D. 1992. PubMedPMID:1495975。pmed中央PMCID:PMC49604

4.通过CRE-LOXP介导的基因靶向证明了各个开关区域的免疫球蛋白开关重组的独立控制。顾,H.,Zou,Y.R.和Rajewsky,K. 1993. PubMedPMID:8513499.

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