质粒101:大肠杆菌菌株用于蛋白质表达

由朱利安泰勒 - 帕克

细菌板在先前的质粒101博客中,我们审查了几种普遍的菌株的突出特征大肠杆菌用于DNA繁殖。虽然非常适合克隆目的,但这些大肠杆菌菌株通常不适合重组蛋白表达。在过度表达外国蛋白质时会出现许多挑战大肠杆菌。我们将审查重组蛋白表达的潜在缺陷和一些最受欢迎的商业菌株,旨在避免它们。

为什么我需要表达菌株?

蛋白质表达高拷贝数质粒强大的推动者将大大超过任何本地宿主蛋白质,使用细胞中的宝贵资源导致增长放缓。另外,当表达时,一些蛋白质产品可能对宿主有毒,特别是那些不溶于DNA的,或者酶活性。因此,通常表达重组蛋白大肠杆菌使用诱导型启动子系统(将稍后讨论)来设计用于容纳高蛋白质载荷。除了下面概述的基础型基因型外,某些专用菌株可用于赋予更大的转录控制,有助于适当的蛋白质折叠,并处理次优代码子使用情况(表1)

少数突变对于全部或大多数表达菌株是常见的,以适应高蛋白质水平,包括:

  • ompt:含有该突变的菌株在外膜蛋白酶VII中缺乏,其减少了表达的重组蛋白的蛋白水解。

  • LON蛋白酶:菌株被完全删除(指定LON或ΔLON)显像,减少表达蛋白质的蛋白水解。

  • HSDS.B.(r.B.-mB.-):这些菌株具有灭活的天然限制/甲基化体系。这意味着菌株既不妨碍也不能甲酸盐DNA。

  • DCM:类似地,具有这种突变的菌株不能在特定序列内甲酸酯胞嘧啶。


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表格1:大肠杆菌表达菌株

注意:所有菌株源自大肠杆菌B菌株,除了K12

拉紧 抵抗性 主要特征 基因型
BL21(DE3) 含有T7 RNAP(DE3)的基本IPTG诱导菌株

F-OMP.T.Lon HSD.S.B.(r.B-mB-GAL DCM.(de3)

一般蛋白表达
BL21(DE3)PLYSS * 氯霉素(底层) Plys表达T7溶菌酶以降低基础表达水平;表达载体不能具有p15a的复制起源

F-OMP.T.Lon HSD.S.B.(r.B-mB-GAL DCM.(DE3)底层(CAMr)

毒性蛋白的表达
BL21(DE3)Plyse * 氯霉素(Plyse) Plyse具有比底层更高的T7溶菌酶;表达载体不能具有p15a的复制起源

F-OMP.T.Lon HSD.S.B.(r.B-mB-GAL DCM.(DE3)PALYSE(CAMR.

毒性蛋白的表达
BL21星(DE3) 缺乏功能性RNASEE,导致更长的成绩单半衰期

F-OMP.T.Lon HSD.S.B.(r.B-mB-GAL DCM RNE131(de3)

一般表达;不推荐用于有毒蛋白质
BL21-A1 四环素 Arabiarose-诱导T7 RNAP的表达;IPTG仍然可能需要表达

F-OMP.T.Lon HSD.S.B.(r.B-mB-gal dcm ara.B :: T7RNAP-删号一种

一般蛋白表达
BLR(DE3) 四环素 缺陷;最适合重复序列的质粒。

F-OMP.T.Lon HSD.S.B.(r.B-mB-GAL DCM.(DE3)δ(SRL-RECA)306 :: TN10.(Tet.r)

不稳定蛋白的表达
HMS174(DE3)** 利福平 缺陷;允许在同一菌株中克隆和表达

F-RECA1 HSDR(rK12-mK12 +)(DE3)(RIFr)

不稳定蛋白的表达
调谐器(DE3) 含有突变的LAC允许WHCH允许表达的线性控制

F-OMP.T.Lon HSD.S.B.(r.B-mB-GAL DCM LACY1.(de3)

毒性或不溶性蛋白的表达
折纸2(de3)** 链霉素和四环素 含有高活性的硫醚素还原酶和谷胱甘肽还原酶,以便适当折叠;可能会增加多聚体形成

δ(ARA-LEU)7697ΔLACX74ΔPHOAPVUII PHOR ARAD139 AHPC GALE GALK RPSL F.'[Lac + Laciq Pro](DE3)GOR522 :: TN10 TRXB(Strr,Tetr)

不溶性蛋白的表达
Rosetta2(DE3)* 氯霉素(PRARE) 有益于“普遍”的翻译;包含7个额外的TRNA,用于通常不使用的稀有密码子大肠杆菌。E.xpression载体不能具有p15a的复制起源 F-OMPT HSDSB(RB-MB-)GAL DCM(DE3)PRARE2(CAMR) 真核蛋白的表达
LEMO21(DE3)* 氯霉素(PLEMO)

rhamnose可调T7 RNAP表达减轻了包含体形成。E.xpression载体不能具有p15a的复制起源

FHUA2 [LON] OMPT GAL(λDE3)[DCM]ΔHSDS/ PLEMO(CAMR)

毒性,不溶性或膜蛋白的表达
T7表达

来自基因组的T7 RNAP的IPTG诱导的表达;不限制甲基化DNA

fhua2 lacz :: t7 gene1 [lon] ompt gal sula11r(mcr-73 :: minitn10-tets)2 [DCM] R(ZGB-210 :: TN10 - Tets)

一般蛋白表达
M15 Prep4 *,** 卡那霉素(Prep4) CIS-压制大肠杆菌T5启动子(在PQE等载体上发现相似的),在IPTG下诱导(PREP4质粒上的LAC阻遏物)。E.xpression载体不能具有p15a的复制起源 F-,φ80ΔLACM15,THI,LAC-,MTL-,RECA +,KMR 毒性蛋白的表达

*表示额外质粒的存在 - 通过在适当的媒体上生长,确保保持这一点。注意:纯化这些菌株的表达质粒不推荐,因为这些胶质质粒可以在预制过程中分离。

诱导型表达如何工作?

如上所述,许多表达质粒利用诱导型启动子,其是“无活性”,直到向生长培养基添加诱导剂,例如IPTG。归纳时机很重要,因为您通常希望确保您的细胞首先达到适当的密度。指数增长阶段的细胞是活跃的和健康的,这使得它们适用于蛋白质表达。如果你等待太久才诱导,你的文化将开始收集死细胞,而且,相反,你不能诱导太早,因为文化中没有足够的细胞来制造蛋白质。

DE3溶酶/ T7启动子组合是最流行的感应系统。DE3溶胶在Lac阻遏物的控制下从细菌基因组表达T7 RNA聚合酶(RNAP),其通过添加IPTG诱导。然后可以使用T7 RNAP从质粒上的T7启动子转录感兴趣的基因。许多商业菌株携带DE3溶血原,如菌株的名称所示。相反,其他菌株如M15(Prep4)使用LAC阻遏物直接作用于表达质粒,以便抑制来自杂交启动子的转录。

虽然DE3 / T7 RNAP系统适用于大多数实验,但LAC启动子可以“泄漏”,这意味着即使在没有添加IPTG的情况下也存在低水平的表达。这主要是有毒蛋白质产品的问题,这可以防止培养物在合理的时间框架内达到所需的密度。对于这些病例,一些菌株携带额外的对照量,例如抑制基底T7表达的帘布层质粒。Plys质粒含有氯霉素抗性盒,用于阳性选择和复制的P15A起点,使其与其他P15A质粒不相容。Plys分为两种味道和底片 - 差异是后者提供了对基础表达的更严格的控制。

如果我没有看到蛋白质过表达怎么办?

上述菌株应为大多数目的产生足够的表达水平,但是当您尝试常见的菌株时,您会做什么,并且没有得到所需的水平(或任何)蛋白质表达?低表达结果可能是由各种来源产生的,因此恐惧不是 - 有一些简单的故障排除措施可以帮助您回到轨道:

  • 兼容性:双重检查您的质粒骨架和表达应变,以确保它们兼容。例如,阿拉伯糖诱导的质粒不会在IPTG诱导菌株中表达,也不是P15质粒与帘布层菌株相容。您的菌株可能需要额外的抗生素选择或特殊的生长培养基,或者如果您的质粒是低拷贝的,考虑降低抗生素浓度。

  • 生长节约:通过设置小规模表达实验来分析表达条件以测试变量,例如温度,时间和媒体条件。许多重组蛋白在30℃或室温下表达更好,这通过将培养物生长到37℃的所需密度并将温度降低或将其移动到台式振荡器10-20分钟之前,在添加诱导剂之前将其移动到台式振动器10-20分钟内完成。

  • 增长媒体:改变媒体很棘手,因为生长率和蛋白质质量之间可能存在权衡。对于许多蛋白质,由于它们支持的高电池密度,富含Tb或2xyt的富介质是最佳的;然而,如果蛋白质产物分泌到培养基或由于溶解度问题需要缓慢表达,则可以优选补充有M9盐的最小培养基。

  • 不溶性和分泌的蛋白质:最常见的纯化方案设计用于可溶性胱糖蛋白产品,但这并不总是可实现的。含有疏水区或多种二硫键的蛋白质可以聚集并变得不溶。这些不溶性蛋白质的不溶性蛋白质被称为包涵体,可以使用a回收和纯化特别方案。或者,减少诱导剂的浓度或添加Advinity标记如GST可能有助于溶解性问题。

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