质粒101:抗生素抗性基因

由马西帕特里克


氨苄青霉素的结构 对抗生素的耐药性是分子生物学中广泛使用的工具,但科学家很少停下来思考它让我们的生活变得多么简单。质粒转化成大肠杆菌这是一个相当低效的过程——平均只有1 / 10000个细胞!如果没有快速确定哪些细胞成功地获得了正确的质粒的方法,科学家将花费数小时到数天的时间试图找到正确的克隆体。此外,a质粒从细菌的角度来看是不利的——一个含有质粒的细胞必须复制质粒,除了它自己的染色体DNA,花费额外的资源来维持质粒。向质粒中添加抗生素抗性基因可以同时解决这两个问题——当细胞在选择性培养基上生长时,科学家可以很容易地检测出含有质粒的细菌,并为这些细菌提供一定的压力来保存质粒。细菌耐药性万岁!

抗生素是什么?

抗生素通常定义为杀死细菌的药剂,或抑制它们的生长。虽然最初来自天然产品,但今天实验室中使用的许多常见抗生素是半合成或全合成的化合物。抗生素可以根据它们是否直接杀死细菌(杀菌)或缓慢的生长/预防细胞分裂(抑菌);然而,两种类别之间的区别可能是灰色区域的一点,因为当在高浓度下使用时,一些抑菌试剂可以杀死细菌(反之亦然)。环顾实验室,您可能会发现下表中列出的许多抗生素。注意,在这篇文章中,我们将主要关注抗生素革兰氏阴性细菌。在f在以后的文章中,我们将详细介绍非细菌细胞的选择,比如酵母或者哺乳动物细胞

的名字 行动方式* 工作浓度* *
卡那霉素

氨基糖苷类

结合30s核糖体亚基;导致错误翻译 杀菌 50 - 100 ug /毫升
奇霉素 氨基糖苷类

结合30s核糖体亚基;中断蛋白质合成

杀菌

7.5 -50 ug /毫升
链霉素 氨基糖苷类

抑制蛋白质合成的起始

杀菌

25 - 100 ug /毫升
氨苄青霉素

β-内酰胺

抑制细胞壁合成 杀菌 100-200 ug / ml
羧苄青霉素

β-内酰胺

抑制细胞壁合成 杀菌 100 ug /毫升
博来霉素

糖肽

诱发DNA断裂 杀菌 5 - 100 ug /毫升
红霉素 Macroolide.

Blocks 50S核糖体亚基;抑制氨酰基易位

抑菌

50-100 ug/mL in EtOH
多粘菌素B

多肽

改变外膜的渗透性 杀菌 10 - 100 ug /毫升
四环素 tetracyclin

结合30s核糖体亚基;抑制蛋白质合成(伸长步骤)

抑菌

10 ug /毫升
氯霉素 结合50S核糖体亚基;抑制肽基易位 抑菌 5-25 ug/mL in EtOH

*在原核生物中。**溶解在DH2O型和无菌过滤器,除非另有说明。

上表列出了实验室中常见的一些抗生素,它们杀灭细菌的机制和一般工作浓度。有关如何配制抗生素库存的说明,请参阅Addgene的参考页

抗生素还能在实验室里怎样使用呢?

在历史上,抗生素也被用来在染色体水平上破坏基因。科学家们在他们试图破坏或删除的基因编码区域内引入抗生素耐药性盒式磁带两者都将基因灭活并用作突变的标志物。当设计这些类型的实验时,最好的做法不使用相同的突变和质粒选择相同的电阻盒。此外,科学家可以使用阻力作为成功克隆的标记。在这些情况下,克隆载体通常具有两个独立的电阻盒,并且您的目的基因被克隆到/灭活或完全移除(在网关克隆)一盒。反选择允许科学家选择那些只对完好无损的抗生素有抵抗力的细菌。

板凳上的技巧

  • 使用新鲜的股票。大多数抗生素在粉末状时是稳定的,但在溶液中很快就会分解。将aliquots存储在-20oC并避免反复冻融/解冻循环将使大多数抗生素可行至少6个月。

  • 氨苄西林分解特别快,为达到最佳效果,应在1个月内使用平板。小心卫星殖民地!

  • 氨苄西林比氨苄西林更稳定,可在大多数应用中替代氨苄西林。

  • 抗生素对热和/或光的敏感性各不相同- - - - - -不要把它们加到媒体热到55度左右o如果使用的是像四环素这样的光敏抗生素,用箔纸包裹盘子/存货。

  • 记住一些大肠杆菌菌株具有天然抗生素抗性,因此确保您的质粒和大肠杆菌应变是兼容的。看看这个常见的列表大肠杆菌基因型以及它们的自然抵抗力。

Addgene博客上的其他资源vwin.com mobile

在Addgene.org上的资源

点击下载addgene的质粒101电子书

不要错过下一个质粒101帖子!点击这里订阅Addgene的博客。

主题:质粒的元素,质粒101,质粒

发表评论

分享科学变得更容易了……订阅我们的博客

订阅