质粒101:弯曲矢量

由米歇尔克里琴

在我们的质粒101系列的前一篇文章中,我们了解了如何CRE-LOXP重组系统可用于诱导特异性特异性的重组事件,并且侧翼LOXP位点的取向将CRE重组酶引导倒置,译,或消除DNA片段。野生型和突变体LOXP网站的可用性使科学家以新的创造性方式利用这个系统。今天的帖子将专注于一个这样的战略 -Flex Switch.- 利用重组元素关闭一个基因的表达,同时同时打开另一个基因的表达!

Flex开关可用于小鼠的条件基因表达

什么是Flex开关?

Flex(或“flIP-前任CISTION“)开关被设计为用于有条件地操纵基因表达的研究人员的基因工具体内使用现场特定的重组。Flex切换利用位点特异性重组酶(SSRS)CRE和FLP的定向特异性。SSRS在靶位点结合DNA以诱导位点特异性重组事件:CRE重组酶结合LOXP位点,而FLP结合FRT位点。当DNA序列由靶位点(氟化)相对取向而侧翼时,SSR将反转位点之间的DNA序列。如果DNA序列以相同的取向散热,则SSR将切除DNA片段。通过操纵闪烁感兴趣的基因的目标网站的数量,方向和类型,可以为您的特定实验需求创建强大的Flex开关。

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Flex切换如何工作?

假设您想设计一个遗传柔性开关,关闭BFP表达,同时打开MCHERRY表达。对于该Flex切换成功工作,盒子需要在感测方向上包含BFP编码序列,然后是反义方向的MCHERRY编码序列(图1,顶部)。整个DNA暗盒将由两对靶位点(LOXP,黑色箭头)和一个突变对(例如 - LOX511,白色箭头)侧翼。有必要使用两对不同的目标站点进行这种策略,有效地工作。LOXP和LOX511都被CRE识别,但LOX511站点只能与其他LOX511站点重新组合,而不是LOXP网站。或者,您可以使用一对LOXP网站和一对FRT网站,并包括CRE和FLP重组酶。

Flex切换以交换BFP以获取MCHERRY表达式

一旦介绍了选择的SSR,重组就可以通过首先利用LOXP网站或LOX551位点进行。无论如何,第一个重组步骤将倒置使用LOxP或LOX511位点的干预DNA片段,在DNA片段的一端留下两个相同的位点(图1,中间)。然后是第二个重组事件兴奋相同的LOXP或LOX511位点之间的DNA(图1,底部)。由于只有一个LOXP和LOX511位点将保留在DNA片段的两侧,即使在CRE重组酶存在下,任何额外的重组事件也是不可能的。这种质粒现在特别是驱动MCHERRY而不是BFP的表达。

除了切换荧光团之外,为什么Flex有用?

Flex系统的力量位于有条件地关闭一个基因并激活另一个基因并激活另一个基因。在小鼠遗传领域,目前正在使用Flex来研究各种各样的体内条件基因救援实验,以及改善致敏性adeno相关病毒(AAV)向量。下面列出了Flex交换机的一些额外用途:

  • 对基因敲门的条件救援:为了测试您观察到的表型真的是由于在敲除鼠标中删除的单个基因,可以设计Flex Switch条件敲入盒式磁带。Flex开关使用CRE激活基因表达As shown in Figure 2, the cassette should contain a reporter DNA sequence (such as GFP) in the sense orientation, followed by coding sequence of the gene you would like to rescue with in the antisense orientation (let’s call the gene “GeneR”). The key to this experiment is the placement of the two pairs of target sites. By flanking the reporter with one loxP site and one lox511 site in the same orientation, and placing the additional loxP and lox511 sites after the inverted GeneR sequence in the opposing orientation, you have created a cassette that will express GeneR only in the presence of Cre. In this example, Cre would first倒置记者和生成片段。然后是第二个重组事件记者从纸盒,允许表达生物。这允许研究人员测试是否单独表达但是单独拯救正在研究的表型。
  • 一世ntroduction有条件点突变或功能突变体内类似于具有基因野生型拷贝的条件救援实验,您还可以设计Flex开关,以便在没有内源基因的情况下有条件地测试各种点突变的功能和截断。
  • Spatio-ysumal表达Optoctic报告者:由于大多数致敏记者使用AAV注射递送,因此注射部位周围的大多数细胞将被感染,并且有可能表达转导的报告基因。生成柔性开关以控制视素报告者的表达将确保报告者保持沉默,直到提供细胞或组织特异性CRE。由于柔性开关确保了依赖于CRE依赖的报告表达,因此将大大减少记者的背景表达的可能性,允许更清楚地表征目标神经元群的位置,形态和电路映射。

有时也称为DIO(D.盎司浮躁一世Nwerse.O.令人诗型),Flex系统通常被认为是“CRE-on”,这意味着您的感兴趣基因从逆/反义“OFF”位置开始,并且在CRE存在下被翻转到方向(上)取向。可以使用类似的策略“Cro-Off”(即,您的感兴趣基因在感知方向上开始,CRE用于将其翻转到“OFF”)。这些Cref-Off开关可以称为DO(D.盎司浮躁O.可归解型)并且可用于研究某些细胞群的生理学或行为。


确认:
通过与基类型的合作,我们能够分配包含Flex技术的材料。阅读基因送释放想要查询更多的信息。

参考:

1.Schnütgenf,doerflinger n,calléjac,wendling o,chambon p和ghyselinck nb。用于监测小鼠细胞水平的CRE介导的重组的定向策略。2003年PUBMED.PMID:12665802

2. Branda,CS和Dymecki,SM。谈论革命:特定特异性重组酶对小鼠遗传分析的影响。2004. PUBMED.PMID:14723844

3. atasoy d,aponte y,su hh和sternson sm。Flex Switch将ChannelRhodopsin-2定位到多个单元格类型,用于成像和远程电路映射。PubMed.PMID:18614669。pmed中央PMCID:PMC2593125.

4. Saunders A,Johnson Ca,Sabatini BL。2012.新型重组腺癌相关病毒,用于神经元中的CRE活化和灭活的转基因表达。PubMed.PMID:2286602。pmed中央PMCID:PMC3406316.

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