质粒101:FLEx载体

由米歇尔·克罗宁

在我们的质粒101系列之前的文章中,我们了解了如何Cre-loxP复合系统可用于诱导位点特异性的重组事件,而侧翼loxP位点的定位指示Cre重组酶倒置、易位或切除DNA片段。野生型和突变型loxP位点的可用性使科学家能够以新的、创造性的方式利用这个系统。今天的文章将聚焦于其中一种策略FLEx开关——利用重组元素关闭一个基因的表达,同时开启另一个基因的表达!

FLEx开关可用于小鼠的条件基因表达

什么是FLEx开关?

FLEx(或“fl知识产权- - - - - -前女友(Cision)开关被设计为一种基因工具,供研究人员有条件地操纵基因表达在活的有机体内使用特有的复合。FLEx开关利用了位点特异性重组酶(SSRs) Cre和FLP的定向特异性。SSRs在靶位点结合DNA,诱导位点特异性重组事件:Cre重组酶结合loxP位点,而FLP结合FRT位点。当一个DNA序列的两侧有不同方向的目标位点(floxed)时,SSR将位点之间的DNA序列进行反位。如果一个DNA序列以相同的方向浮动,SSR将切除DNA片段。通过控制让你感兴趣的基因流动的目标位点的数量、方向和类型,可以创建一个功能强大的FLEx开关来满足你的特定实验需求。

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FLEx开关是如何工作的?

假设您想要设计一个基因FLEx开关,关闭BFP表达,而打开mCherry表达。为了让FLEx开关成功工作,盒式磁带需要包含意义方向的BFP编码序列,然后是反义方向的mCherry编码序列(图1,顶部)。整个DNA盒两侧有两对目标位点——一对野生型(loxP,黑色箭头)和一对突变型(例如lox511,白色箭头)。为了使该策略有效地工作,必须使用两对不同的目标位点。loxP和lox511都被Cre识别,但lox511位点只能与其他lox511位点重组,而不能与loxP位点重组。或者,你可以使用一对loxP位点和一对FRT位点,同时包含Cre和FLP重组酶。

FLEx开关交换BFP的mCherry表达式

一旦引入所选择的SSR,可以首先利用loxP位点或lox551位点进行重组。无论如何,重组的第一步将会用loxP或lox511位点介入DNA片段,在DNA片段的一端留下两个相同的位点(图1,中间)。然后是第二次重组首次将相同loxP或lox511位点之间的DNA(图1,底部)。由于只有一个loxP和lox511位点将保留在DNA片段的两侧,任何额外的重组事件是不可能的,即使存在Cre重组酶。这个质粒现在专门驱动mCherry的表达,而不是BFP。

除了切换荧光团,FLEx还有什么用呢?

FLEx系统的强大之处在于能够有条件地关闭一个基因并激活另一个。在小鼠遗传学领域,FLEx目前被用于研究各种各样的在活的有机体内条件基因拯救实验,以及光遗传学的改进腺相关病毒(AAV)载体。下面列出了FLEx开关的一些其他用途:

  • 基因敲除的条件拯救:为了测试你正在观察的表型是否真的是由敲除小鼠中删除的单个基因引起的,你可以设计一个FLEx开关条件敲入盒。FLEx开关使用Cre激活基因表达如图2所示,该盒式磁带应包含意义取向的报告DNA序列(如GFP),然后是你想要拯救的基因的反义取向编码序列(我们称该基因为“GeneR”)。这个实验的关键是两对目标位点的放置。通过用一个loxP位点和一个lox511位点以相同的方向包围报告者,并将另外的loxP位点和lox511位点以相反的方向放在倒置的GeneR序列之后,您就创建了一个仅在Cre存在时表达GeneR的盒式磁带。在本例中,首先是Cre记者和GeneR片段。然后是第二次重组特许权记者从录音带中取出,容许格尔表达。这使得研究者可以测试是否仅表达GeneR挽救了被研究的表现型。
  • 引入条件点突变或功能突变在活的有机体内:与基因野生型副本的条件拯救实验类似,您还可以设计FLEx开关,在没有内源性基因的情况下,有条件地测试各种点突变和截断的功能。
  • 光基因报告者的时空表达:由于大多数光遗传报告基因是通过AAV注射剂递送的,因此注射部位周围的大部分细胞都会被感染,并有可能表达转导的报告基因。生成FLEx开关来控制光遗传报告基因的表达可以确保报告基因在提供细胞或组织特异性Cre之前保持沉默。由于FLEx开关确保了cre依赖的报告基因的表达,报告基因背景表达的可能性将大大降低,从而能够更清晰地表征目标神经元种群的位置、形态和电路映射。

有时也称为DiO (Double-floxednverseO), FLEx系统通常被认为是“creon”,这意味着你感兴趣的基因从逆/反义“关闭”位置开始,在Cre存在时被翻转到意义(开)方向。类似的策略也可以用于“creoff”(即你的兴趣基因从感觉定向开始,Cre用来把它翻转到“off”)。这些creoff开关可称为DO (Double-floxedO取向),并可用于研究某些细胞群体的生理或行为。


确认:
通过与genOway的合作,我们能够分发包含FLEx技术的材料。读了genOway新闻稿为更多的信息。

引用:

1.Schnütgen F, Doerflinger N, Calléja C, Wendling O, Chambon P, Ghyselinck NB。在小鼠细胞水平上监测cre介导的重组的定向策略。2003年PubMedPMID: 12665802

2.布兰达,CS和Dymecki, SM。“谈论一场革命:位点特异性重组酶对小鼠遗传分析的影响”,2004。PubMedPMID: 14723844

3.Atasoy D, Aponte Y, Su HH,和Sternson SM。2008.FLEX开关将Channelrhodopsin-2定位到多种细胞类型,用于成像和远程电路映射。PubMedPMID: 18614669。公共医学中心PMCID: PMC2593125

4.Saunders A, Johnson CA, Sabatini BL. 2012。新型重组腺相关病毒在神经元中Cre激活和灭活转基因表达。PubMedPMID: 2286602。公共医学中心PMCID: PMC3406316

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