质粒101:网关克隆

通过玛丽亚索里亚诺

在面对克隆项目时,科学家不再限于传统限制酶克隆。相反,您可以选择一种分子克隆技术,它将在给定的资源、时间和实验需求下很好地工作。Gateway克隆技术自上世纪90年代末发明以来,作为一种快速、高效地将DNA序列转移到多个载体系统中的方法,已成为一种非常受欢迎的技术。有了适当的输入和目的地载体,人们可以使用Gateway将一个感兴趣的基因克隆到各种表达系统中。继续阅读,了解更多关于网关克隆方法及其优点。

介绍网关技术

网关克隆法,由表达载体, 是一个在体外当λ噬菌体感染细菌时发生的集成和切除重组反应的版本。n体内,T.催化剂促进了这些复合反应噬菌体附着位点的重组(丙氨酸P)和细菌(丙氨酸B)。由于ATTP和ATTB位点之间的重组,噬菌体将含量含有两个新的重组位点的细菌基因组(丙氨酸l离开了,丙氨酸R-右-,图1)丙氨酸l丙氨酸R网站可以重组,导致细菌染色体和再生切除噬菌体的切除丙氨酸P丙氨酸B网站。

噬菌体整合和切除

门户网关vectors包含修改版本的丙氨酸这样科学家们就可以很容易克隆他们想要的DNA序列。网关技术依赖于以下两种反应:

BP反应发生在丙氨酸B侧翼的插入和丙氨酸P供体载体的网站。该反应由BP克隆酶混合催化并产生进入克隆含有嘴巴的DNA丙氨酸l网站。作为反应的副产品ccdB从供体载体上切除基因。

Gateway BP和LR反应

LR反应发生在丙氨酸l生成的入口克隆的网站和丙氨酸R目标向量的位置。这个反应是由LR Clonase酶混合物催化的。结果,一个克隆表达有兴趣的DNA就在旁边丙氨酸B站点是生成的。与BP反应一样,含有ccdB基因从目标载体中被切除

一旦BP和/或LR反应完成,下一步就是转化胜任力大肠杆菌细胞并选择阳性克隆。进入克隆和目的地载体携带不同的抗生素抗性标记物(通过质粒颜色表明),允许您轻松选择表达克隆。您还需要使用大肠杆菌应变敏感CcdB(如。DH5α,Top10,Mach1)。的ccdB基因存在于供体载体中和目的地向量并在BP或LR反应中与感兴趣的基因交换。自CCDB蛋白质抑制CcdB敏感的生长大肠杆菌菌株,大多数菌落应该包含所需的重组结构。阅读我们最近的质粒101帖子CcdB为更多的信息。

如何使用Gateway技术进行克隆

为了更好地理解该过程,我们将通过一个示例实验,我们可以使用网关克隆来产生所需的构建体:哺乳动物细胞中人KRA基因的慢病毒表达。

第1步:生成条目克隆

有几种不同的方法来产生我们想要的进入克隆人喀斯特的陪同下attL网站。

方法一:重组A.丙氨酸B-PCR产物或质粒丙氨酸P捐赠者vecto.r。在这种情况下,我们将使用PCR添加丙氨酸B站点到任何一端喀斯特编码序列。如果您选择此策略,则重要的是包含适当的蛋白质表达元素(核糖体识别序列,起始密码子,停止密码子,阅读框架注意事项等)这个视频控件的使用Snapgene程序来设计门户网关质粒。

attB PCR.png

方法B:TOPO-cloning所需插入物中丙氨酸l-entry-TOPO向量。TOPO克隆添加短端(s)以方便克隆到丙氨酸l- 入境向量。

威尼斯平底渔船cloning.png

方法C:限制克隆限制性内切酶的片段,包含感兴趣的DNA和丙氨酸l进口向量。该片段被插入到一个多克隆位点(MCS)丙氨酸l- 入境向量。

限制克隆

专家提示:加入也有现成的入口克隆适用于许多流行的基因,包括海关。KRAS4a。使用我们的网站搜索您最喜欢的基因!

第2步:生成表达式克隆

在制作表达式克隆时,重要的是选择最适合您实验的目标向量。这种选择取决于许多因素,如您的生物,所需的表达水平和实验目的。对于哺乳动物慢病毒表达,我们可以使用像这样的载体Plenti CMV Puro Dest(W118-1)或doxycycline-inducibleplix_402。所选的丙氨酸R目标向量将与tl-entry clone用于创建表达式clone。

生成表达式克隆

第3步:表达你感兴趣的基因!

请确保验证您的表达克隆的完整性通过测序或限制性摘要!!然后,您可以转换或转发要用于实验的单元格,并验证您的构造是否正常。

网关克隆方法的优点

兼容性和灵活性

一旦你产生与你感兴趣的DNA序列的进入克隆,你可以移动这个DNA片段跨任何表达系统在一个重组步骤。Addgene现成的进入克隆可以用于多种质粒。

速度

网关系统使得仅在1天内生成表达构建体,而与传统的限制和结扎克隆相反。还可以在同一管中设置BP和LR反应,加速克隆的克隆丙氨酸B-PCR产物直接进入目的载体。克隆过程是简单的-没有限制,连接或凝胶纯化步骤是必需的!

多个片段克隆

您可以使用网关克隆在同一管中立即将多个DNA片段插入许多载体。您可以在一个网关向量中以特定顺序和取向,在一个管中以特定顺序和取向克隆到一个网关向量以产生所需的表达克隆。由于网关向量的设计,这是可能的。他们有修改版本的丙氨酸B,P,lR有针对性地重组的网站:丙氨酸B1网站只对attp1.网站;attb2.只有attp2.,attL1只有attR1;attL2只有attR2, 等等。看看Addgene提供的一些网关多路质粒,包括Frew Lab多种慢病毒表达系统(MuLE)试剂盒,MultiSite Gateway克隆试剂盒,多路网关质粒

不断的阅读框

当从一个网关向量移动到另一个网关向量时,插入的DNA片段保持在框架中。

效率高

Gateway克隆使用的阳性(抗生素)和阴性(CcdB)选择标记可将克隆效率提高至>99%。

普遍性

可以克隆所有类型的DNA片段:PCR片段,cDNA或基因组DNA,可用于来自哺乳动物的所有种类生物大肠杆菌

网关克隆媒体词汇表

矢量类型 向量的特性 目的
捐赠者向量 attP重组的网站;ccdB负选择基因 曾经克隆丙氨酸B生成的兴趣基因进入克隆
输入向量 attL重组的网站 用来生成进入克隆通过威尼斯平底渔船克隆或通过限制克隆
目标向量 attR重组的网站;ccdB负选择基因;元素在适当的系统中表达感兴趣的基因 重新结交条目克隆以生成一个克隆表达

准备好尝试Gateway克隆了吗?

世界各地的许多科学家已经生成并存放了他们自己的与Addgene通路兼容的质粒。这些基因可以用来表达多种模式生物的基因。使用下面的链接为你感兴趣的生物体找到Gateway质粒:

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参考文献

1.[23]迟建勇,陈春林(2015)网关克隆技术的优势与不足。克隆Transgen 4:138。doi: 10.4172 / 2168 - 9849.1000138

2.哈特利杰。多主机中蛋白质表达网关系统的使用。第五章:第5.17单元。PubMedPMID:18429245.

3.Ptashne, m(1992)。基因开关:噬菌体(Lambda)和高等生物(剑桥,MA: Cell Press)。

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主题:质粒101,质粒克隆,质粒

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