质粒101:Gibson组装和其他长同源克隆方法

由布鲁克Pyhtila

在过去的十年里,科学家们开发和调整了许多不同的方法来克隆DNA片段,这些方法为克隆DNA片段提供了吸引人的替代品限制酶克隆。这些较新技术已经变得越来越普遍,并且有充分的理由。它们提供了与传统的限制酶克隆相比,我们曾经专门依赖的传统限制酶。在本博客文章中,我将占据一些优点,缺点,以及科学家如何使用Gibson组装将DNA片段组合在一起。

作为一个有趣的开始,我强烈推荐你看这个有趣的视频由我们的朋友在剑桥2010年IGEM团队这描述了Gibson组装作为“蒂芙尼早餐”的模仿的基础知识。

吉布森大会概述

吉布森装配技术于2009年由克雷格文特尔研究所的丹尼尔吉布森博士及其同事首次描述。在Addgene,我们把这个选项添加到下拉菜单的常见克隆选项存款过程2014年由于其受欢迎程度。众所周知,吉布森组装众所周知,允许易于组装多个线性DNA片段,但也可以用于嵌件的基本克隆到您的选择载体中,如下图所示。为了开始,您需要在其末端具有具有同源性区域的DNA片段,其通常由PCR产生。然后,将片段与酶主混合物一起温育,该酶含有三种不同的酶:

  • 一个外切酶,它咬回片段的5 '端,产生长伸出,使具有同源性的单链区域退火
  • 一种聚合酶,填补空白
  • DNA连接酶,密封退火和填充间隙的缺口

这种酶的混合物最棒的地方在于它们都能在相同的温度下工作,所以整个反应在50°C下只需1小时或更少的时间就能完成。大约一小时后,样品立即准备转化为感受态细胞。主要混合酶可以从一个公司购买(如NEB或SGI-DNA),或可以自己混合(如见米勒实验室协议)。Gibson组装过程可用于在一步中组装多达6个碎片,导致无疤痕组件,不需要特定限制性位点(或缺乏其)也不需要严重的时间承诺。另一个优点是该过程使得易于同时产生野生型和突变构建体,而不是顺序。

吉布森装配一插页

吉布森装配是如何工作的?

利用包含相应同源序列的引物进行PCR扩增,可以获得相邻片段之间所需的同源性。内建议重叠为15-40bp,引物熔化温度大于48℃。Snapgene和NEB都具有帮助您设计PCR扩增碎片的引物以纳入这些同源区域的工具。这个视频有助于展示如何使用的Snapgene的程序为Gibson装配设计引物。

有关使用Gibson组件的简单示例,想象您希望将您的感兴趣的基因插入到具有大的向量中标签在n-terminus,但您没有您想要使用的矢量中已包含的标签。如果通过限制酶克隆插入这两片DNA,则必须分两步进行,并且可能留在两个碎片之间。但是,通过使用Gibson组件,您可以在一个步骤中插入感兴趣的基因和标签序列的一步,而不是如下所示的疤痕。首先,您需要设计引物以放大两个片段,同时还包括对载体或相邻片段的同源区域的区域。然后,您将通过PCR放大碎片和向量,验证您是否具有正确尺寸的频段,并净化DNA片段。最后,您只需将这三个碎片孵育在一起,以及Gibson装配主组合1小时,然后转化为态度。这种反应的成功率通常相当高,所以通常不需要筛选大量的菌落。除去获得引物所需的时间,你可以在5天内完成你的构造。

吉布森装配有两个插入物

Gibson组装技术的一个缺点是该过程最佳地适用于200克多核苷酸的碎片。这可能是因为在发生退火和聚合步骤之前,外切核酸酶可以通过短于200个核苷酸的整个片段来咀嚼。其次,如果片段的末端具有稳定的单链DNA二级结构,则不起作用,例如发夹或茎环(如可能预期发生在终止子序列中),因为这将直接竞争所需的相邻组装碎片的单链退火和启动。

Gibson组装通常用于合成生物学,主要是因为在一步中易于组装多个片段,在一步中没有疤痕序列留在最终产品中。与用限制摘要留下的较小的重叠序列相比,片段之间的长重叠区域还更好地确保片段的正确装配顺序。2013年的一项研究发现,Gibson组装是最常用的装配方法之一(2013年卡尔)。然而,吉布森组装对于合成生物学标准来说并不理想,它依赖于在实验之间重复使用部件。在Gibson组装,长引物为每个片段必须设计和排序,并为每个片段以及你想要的片段旁边,所以这不允许混合和匹配许多不同的片段。解决这个问题的一种方法是使用带有重叠区域的标准序列的组合,例如莫代尔(带链接器的模块化重叠定向程序集)为重叠定向方法带来模块化(Casini 2014.)。在这种情况下,在同源区域之前添加接头序列,其允许混合和匹配部件。

浏览质粒可用作克隆等级DNA!

吉布森大会遇到了Crispr

吉布森可以适应更复杂的克隆方案,例如你想要使用的矢量非常大的那些,具有高的GC内容,包含很多重复 - 任何一个都可以使PCR步骤变得困难 - 或者没有方便的限制性位点进行线性化。这是使用Gibson组装与流行相结合的理想情况CRISPR技术并在最近由奴才实验室发布(王,等。2015年)。在这种情况下,不是使用限制性内切酶或PCR来制作线性化的载体,而是使用Cas9酶和特定的gRNA来切割22kb的载体。当遵循上述标准Gibson组装技术时,这将导致直接无缝克隆到一个没有其他方法可用的载体。最近还描述了将Gibson Assembly与CRISPR一起使用的第二个例子(江等人。2015年),其中细菌染色体的非常大的片段(最多100kb)通过CRISPR特异性地切出,然后使用Gibson组件组装成载体。在这种情况下,载体被PCR扩增以含有细菌染色体片段的同源区域。CRISPR切割用于规避PCR扩增染色体的碎片的需要,这在技术上具有挑战性。

基于其他同源性的技术

我们已经描述过序列和结扎独立克隆(SLIC)在之前的质粒101文章中。尽管SLIC的成本效益更高,Gibson装配改进了SLIC方法的两个方面。首先,它使用专用的5 '外切酶,而不是使用T4 DNA聚合酶的外切酶特征,这必须由dntp的存在或不存在来控制。其次,在Gibson装配中添加了一个连接酶来修复刻痕体外,而在SLIC中,这些结构被修复在活的有机体内,最终效率较低。

除了SLIC和Gibson之外,还有更多的基于同源性的组装方法 - CPEC(圆形聚合酶延伸克隆)和切片(无缝结扎克隆提取物)来说是另外两个。同样地,有几个可用的商店购买的克隆套件,全部基于长重叠区域,对限制酶没有任何要求,并且片段之间没有瘢痕序列。其中一些产品包括:

虽然这些套件可能会以高价格出现,但其制造商涉及效率和低时间承诺。这些套件还具有特定的协议,用于插入产品的比例的建议,以及引物设计的工具,因此最好能够使用您将使用的特定工具包的特定制造商的说明进行办理入住手续。其中一些产品可能提供吉布森组装不增加效率,更短的孵化时间或容纳较小碎片的能力等优势。

知道你的克隆方法

还有另外两种常见的克隆方法很容易与Gibson汇编混淆(它们都以G开头),但实际上使用的方法截然不同。金门克隆确实导致片段的无缝连接,但使用位点特异性限制性位点(IIS型限制性内切核酸酶)来切割识别序列之外的DNA。这要求载体和DNA片段在正确的位置含有这些位点,而不是在插入的中间。网关克隆利用λ整体酶催化通过整合酶识别的attB和ATTP位点的正交版本侧翼的DNA部件的定向克隆。该方法需要含有这些集成位点的专门载体并在片段之间留下疤痕,但允许将DNA片段从一个载体易于移动到另一个载体。

现在有很多不同的克隆方法。Gibson和其他基于长同源性的克隆方法是标准限制/连接、网关或金门克隆方法的有用替代品。无论是常规克隆,组装多个片段,或合成生物学,你应该考虑试试看!

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引用:

1. Gibson DG,Young L,Chuang Ry,Venter Jc,Hutchison Ca 3rd,Smith Ho。DNA分子的酶促组装高达几百千碱基。NAT。方法2009;6,343-345。PubMedPMID:19363495.

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4.卡尔,L. J. &恩迪,D.合成生物学中使能技术的概况。生物。Eng。2013;7日,13岁。PubMedPMID:23663447。公共医学中心PMCID:PMC3684516。

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