质粒101:金门克隆

由玛丽传动装置

addgene的质粒与各种基于限制的酶的克隆方法一起使用。每种方法都有自己的加号和减数,但金门克隆在两者中都特别有用合成生物学基因组工程字段。我们将介绍如何将这种精确且易于使用的系统应用于您的克隆工作。

金门克隆技术依赖于IIS型限制酶,于1996年首次发现。IIS型限制酶从“传统”限制酶中是独一无二的,因为它们在其识别序列之外切割,产生四个基部侧翼悬垂。由于这些悬垂不是识别序列的一部分,因此可以定制它们以直接组装DNA片段。设计正确时,识别位点不会出现在最终构造中,允许精确,无尾克隆。

克隆方案如下:感兴趣的基因设计为IIS型位点(如BsaI或BbsI),位于裂解位点的外部。因此,这些位点被消化/结扎消除,不会出现在最终结构中。目的载体含有直接装配最终结扎产物的互补外延的位点。如下图所示,具有5 '悬垂TGGA和3 '悬垂TCCG的片段可以被连接到包含这些悬垂的载体中。进入DNA过量可能存在于原质粒中(选项1)或通过pcr扩增添加(选项2)。金门克隆的原理图

金门克隆的优势

就动手时间而言,金门克隆是最简单的克隆方法之一,因为消化和连接可以在一个30分钟的反应中完成。目的载体和进入载体放置在包含IIS型酶和连接酶的单管中。虽然最初的目标向量+插入可能会自发地依赖,但这个瞬态构造保留了功能类型IIS站点,并将被重新消化。相反,理想的连接产物的形成是不可逆的,因为这种结构不保留酶的识别位点。因此,结扎过程的效率接近100%。金门克隆的另一个优势是它的可扩展性。独特的4个碱基悬空可以用来组装多个碎片-多达10个碎片通常组装在一个单一反应!这些突出部分指定了所需的片段顺序,而连接后酶识别位点的丢失有利于构建感兴趣的结构。虽然随着片段数量的增加,或者非常小/非常大的片段的连接可能会降低效率,但这些问题可以通过筛选更多的潜在克隆来解决。金门大会有一些优势其他克隆方法。Exonuclease-based方法如吉布森组装在DNA片段的末端需要20-40bp的同源性,以指定装配顺序,因此使用该方法不能组装5'或3'序列同源的片段,但可以用金门组装。流行网关克隆系统产生具有编码八个氨基酸的attb重组瘢痕的构建体,但是金门组件可以设计成无尾。金门组件也比许多商业克隆方法昂贵。用金门克隆技术组装多个片段

金门和合成生物学

合成生物学家利用了金门克隆技术的力量,形成了模块化克隆策略。有时被称为MoClo,这种策略使用IIS型限制性内切酶BsaI和BpiI/BbsI一次有效地组装多达6个DNA片段。与所有基于金门的方法一样,该系统利用IIS型酶在其识别位点外剪切的能力,允许具有兼容的外挂的DNA片段有效地组装。科学家们可以设计出独特的酶识别位点,使其位于DNA片段侧翼的反方向。这使得多个DNA组件(启动子、基因、终止子等)可以在单个反应中以正确的顺序组装。对于详细的Golden Gate协议,有用的乐于助人的提示和技巧,参见Sainsbury实验室网站断& Marillonet

金门和基因组工程

2011年初,Bogdanove和Voytas团队描述了一种新的基于金门的技术用于基因组编辑,允许多个DNA片段的有序组装,以创建TAL效应核酸酶。设计这些质粒利用BsaI和BsmBI键入IIS.这样的网站,只需几个步骤就可以快速高效地构建自定义TAL数组。最近,CRISPR技术改编了金色门克隆将指定gRNA目标序列的适当寡核苷酸插入含有cas9的质粒中,例如pX330这种克隆策略不仅使得易于形成单个GRNA表达的质粒,而且还可以适于表达多个GRNA。addgene有两种基于金门的gRNA组装方法可用,允许您将高达7个GRNA有效地克隆到一个目的地向量,使复用容易。

浏览质粒可用作克隆等级DNA!

金门克隆的缺点

Golden Gate Cloning不是100%序列独立:为了避免不希望的消化,所用的IIS类型不得存在于您寻求组装的碎片内。围绕这一点的一种方法是“驯化”你的片段:基于PCR的扩增可用于在内部识别现场创造静音点突变,从而消除来自您感兴趣的基因。然后用IIS型酶消化PCR产物,并在热灭活步骤后连接混合物。如果您的感兴趣或目标矢量的基因包含可能不适合“驯化”的多个内部限制站点,则可能希望使用像网关克隆或Gibson组装等替代方法考虑。另一个重要的考虑因素是侧翼悬垂的设计。尽管有256个不同的侧翼序列,但仅通过一个碱基而异的序列可能导致意外的连接产品。

无论您是否使用金门方法来创建CRISPR/Cas9结构体,组装标准质粒部分用不同的组合,或其他新的和令人兴奋的应用程序,该系统是一个非常强大的工具,用于克隆单一高效步骤中的复杂结构。


引用:

利用iis类限制性内切酶串联扩增克隆DNA。Lee JH, Skowron总理,Rutkowska SM, Hong SS, Kim SC。肛门肛门。1996年12月; 13(6):139-45。pubmed。

一锅,一步,高精度克隆方法,高通量能力。Engler C,Kandzia R,Marillonnet S.普罗斯一体杂志2008;3 (11):e3647。doi: 10.1371 / journal.pone.0003647。2008年11月5日。pubmed。

定制Talen的高效设计和组装和基于TAL效应的构建体的DNA靶向。Cermak T,Doyle El,Christian M,Wang L,Zhang Y,Schmidt C,Baller Ja,Somia NV,Bogdanove AJ,Voytas DF。核酸RES。2011年7月,39 (12):e82。Epub 2011年4月14日。pubmed。

金门克隆。Engler C,Marillonnet S.方法Mol Biol。2014; 1116:119-31。doi: 10.1007 / 978 - 1 - 62703 - 764 - 8 - _9。pubmed。

更多资源Addgene:

点击下载Addgene的质粒101电子书

话题:质粒101.质粒克隆质粒

留下你的评论

分享科学变得更容易了……订阅我们的博客

订阅