质粒101:金门克隆

由玛丽传动装置

Addgene的质粒用于多种限制性酶克隆方法。每种方法都有自己的优缺点,但金门克隆在这两种方法中都特别有用合成生物学基因组工程字段。我们将指导您如何将这个精确且易于使用的系统应用到您的克隆工作中。

金门克隆技术依赖于IIS型限制性内切酶,该酶于1996年首次被发现。IIS型限制性内切酶与“传统”的限制性内切酶是独特的,因为它们在识别序列之外剪切,产生四个碱基侧翼突出。由于这些突出部分不是识别序列的一部分,它们可以被定制为直接组装DNA片段。当设计正确时,识别位点不会出现在最终的构造中,允许精确的无疤痕克隆。

克隆方案如下:感兴趣的基因设计为IIS型位点(如BsaI或BbsI),位于裂解位点的外部。因此,这些位点被消化/结扎消除,不会出现在最终结构中。目的载体含有直接装配最终结扎产物的互补外延的位点。如下图所示,具有5 '悬垂TGGA和3 '悬垂TCCG的片段可以被连接到包含这些悬垂的载体中。进入DNA过量可能存在于原质粒中(选项1)或通过pcr扩增添加(选项2)。金门克隆原理图

金门克隆的优势

就动手时间而言,金门克隆是最简单的克隆方法之一,因为消化和连接可以在一个30分钟的反应中完成。目的载体和进入载体放置在包含IIS型酶和连接酶的单管中。虽然最初的目标向量+插入可能会自发地依赖,但这个瞬态构造保留了功能类型IIS站点,并将被重新消化。相反,理想的连接产物的形成是不可逆的,因为这种结构不保留酶的识别位点。因此,结扎过程的效率接近100%。金门克隆的另一个优势是它的可扩展性。独特的4个碱基悬空可以用来组装多个碎片-多达10个碎片通常组装在一个单一反应!这些突出部分指定了所需的片段顺序,而连接后酶识别位点的丢失有利于构建感兴趣的结构。虽然随着片段数量的增加,或者非常小/非常大的片段的连接可能会降低效率,但这些问题可以通过筛选更多的潜在克隆来解决。金门大会有一些优势其他克隆方法。Exonuclease-based方法如吉布森组装需要DNA片段末端的20- 40bp的同源性来指定组装顺序,所以5 '或3 '序列同源的片段不能用这种方法组装,但可以用Golden Gate组装。受欢迎的网关克隆系统用编码8个氨基酸的attB重组疤痕产生结构,但金门组装可以被设计成无疤痕。金门组装也比许多商业克隆方法便宜。用金门克隆技术组装多个片段

金门和合成生物学

合成生物学家利用了金门克隆技术的力量,形成了模块化克隆策略。有时被称为MoClo,这种策略使用IIS型限制性内切酶BsaI和BpiI/BbsI一次有效地组装多达6个DNA片段。与所有基于金门的方法一样,该系统利用IIS型酶在其识别位点外剪切的能力,允许具有兼容的外挂的DNA片段有效地组装。科学家们可以设计出独特的酶识别位点,使其位于DNA片段侧翼的反方向。这使得多个DNA组件(启动子、基因、终止子等)可以在单个反应中以正确的顺序组装。有关详细的金门协议,包括有用的提示和技巧,请参阅塞恩斯伯里实验室网站断& Marillonet

金门大桥和基因组工程

2011年初,Bogdanove和Voytas团队描述了一种新的黄金Gate-based技术用于基因组编辑,允许多个DNA片段的有序组装,以创建TAL效应核酸酶。设计这些质粒利用BsaI和BsmBIIIS类型这样的网站,只需几个步骤就可以快速高效地构建自定义TAL数组。最近,CRISPR技术已经适应了Golden门的克隆将指定gRNA目标序列的适当寡核苷酸插入含有cas9的质粒中,例如pX330这种克隆策略不仅可以简单地克隆出表达单一grna的质粒,而且还可以表达多个grna。Addgene已经两种基于金门的gRNA组装方法,它允许你有效地克隆多达7个gRNAs到一个目的地载体,使多路复用容易。

浏览质粒可作为克隆级DNA!

金门克隆的缺点

金门克隆不是100%序列独立的:为了避免不希望的消化,所使用的Type IIS站点不能出现在您寻求组装的片段中。解决这个问题的一种方法是“驯化”你的片段:基于pcr的扩增可以用来在内部识别位点产生无声点突变,从而从你感兴趣的基因中消除这些突变。PCR产物然后用IIS型酶消化,在热失活步骤后连接混合物。如果您感兴趣的基因或目的载体含有多个可能无法“驯化”的内部限制位点,您可能需要考虑使用Gateway克隆或Gibson组装等替代方法。另一个重要的考虑因素是侧翼悬挑的设计。虽然理论上有256个不同的侧翼序列,但只相差一个碱基的序列可能导致非预期的连接产物。

无论您是否使用金门方法来创建CRISPR/Cas9结构体,组装标准质粒部分在不同的组合,或其他新的和令人兴奋的应用,这个系统是一个难以置信的强大工具克隆复杂的结构在一个单一,高效率的步骤。


引用:

利用iis类限制性内切酶串联扩增克隆DNA。Lee JH, Skowron总理,Rutkowska SM, Hong SS, Kim SC。麝猫肛门。1996年12月,13(6):139 - 45。PubMed。

一锅,一步,高精度克隆方法,高通量能力。恩格勒,坎德齐亚R,玛丽罗内特S。《公共科学图书馆•综合》杂志2008;3 (11):e3647。doi: 10.1371 / journal.pone.0003647。2008年11月5日。PubMed。

用于DNA靶向的定制TALEN和其他TAL效应器的高效设计和组装。Cermak T, Doyle EL, Christian M, Wang L, Zhang Y, Schmidt C, Baller JA, Somia NV, Bogdanove AJ, Voytas DF。核酸Res。2011年7月,39 (12):e82。Epub 2011年4月14日。PubMed。

金门克隆。恩格勒C,玛丽罗内特S。杂志的方法。2014; 1116:119-31。doi: 10.1007 / 978 - 1 - 62703 - 764 - 8 - _9。PubMed。

Addgene网站的更多资源:

点击下载Addgene的质粒101电子书

主题:质粒101,质粒克隆,质粒

留下你的评论

分享科学变得更容易了……订阅我们的博客

订阅