vwin德赢娱乐平台荧光蛋白101:绿色荧光蛋白(GFP)

由马西帕特里克

GFP小鼠来自蛋白质的生物发光和荧光,例如绿色荧光蛋白(GFP)可能存在于百年百年多年的生物中存在;然而,直到20世纪60年代,科学家开始研究GFP并推导出其生化特性。现在GFP及其荧光衍生物是实验室的主食。GFP用于研究大量生物学学科,科学家们使用GFP广泛的功能,包括:标记基因,用于阐明其表达或定位型材,作为生物传感器或细胞标志物,研究蛋白质 - 蛋白质相互作用,可视化启动子活动,还有更多。

继续阅读以了解更多关于绿色fp的知识,科学家们是如何进化出这种多用途的蛋白质来满足他们的实验需要,以及实验室中的一些常见应用。

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为什么绿色荧光蛋白?

GFP是一个〜27kDa蛋白,由238个氨基酸组成,衍生自晶体水母Aequorea Victoria。它在可见光谱的绿色部分中具有荧光发射波长(因此名称),这是由于由蛋白质中心的三种特异性氨基酸的成熟反应形成的发色团(Ser65,Tyr66和Gly67)。在首次发现时,GFP最令人惊讶的方面之一是发色团的自发形式,无需额外的共同因子,底物或酶活性- - - - - -它只需要在成熟过程中存在氧气。这意味着蛋白质可以直接从中取出答:维多利亚并在任何生物体中表达,同时仍然保持荧光。

1996年首次报道的蛋白质结构是一个包含11个β膜的“桶”形结构,发色团隐藏在结构的中心,不被水溶剂猝灭。这种紧密排列的结构解释了整个GFP蛋白的重要性,它几乎完全需要维持荧光活性;很少的截断是可以容忍的,但是点突变是可以接受的。与当时的传统荧光染料相比,GFP的主要优势在于它无毒,并且可以在活细胞中表达,从而能够研究动态的生理过程。

重新设计GFP以增加其颜色和应用范围

酵母膜蛋白GFP RFP

几乎在其序列阐明后,科学家通过诱变开始工程新版本的GFP,以改善其物理和生化特性。1995年,Roger Y. Tsien描述了一种增加荧光强度和荧光强度的S65T点突变光稳定性GFP。这也将其主要励磁峰从395nm达到488nm转变,有效改善了野生型蛋白质中发现的缺陷,并促进其在研究中的广泛使用。由于引入GFP以来,许多其他突变已经始终被设计为GFP和荧光团的新迭代。下面的表1列出少数常见的荧光蛋白及其相对于野生型vwin德赢娱乐平台GFP的突变。虽然这里没有列出,但每一种颜色内的许多渗透也存在,只有轻微的变化分离它们。

请注意在光谱的红色一侧发现vwin德赢娱乐平台的许多荧光蛋白不是GFP衍生物,而是与从心脏病瘤。人们已经做了类似的工作来扩大红色荧光蛋白库;然而,这些蛋白质是独特的GFP和突变定义见表2可能不适用。

表1:包含常见荧光团的特定突变

荧光蛋白 相对于野生型GFP的突变
EGFP F64L;S65T
EYFP S65G;V68L;S72A;T203Y.
myfp. S65G;V68L;Q69K;S72A;T203Y;A206K
茶晶 S65G;V68L;Q69K;S72A;T203Y.
ECFP. F64L;S65T Y66W;N146I;M153T;V163A
MCFP. F64L;S65T Y66W;N146I;M153T;V163A;A206K
天蓝色的 F64l、s65t、y66w、s72a、y145a、h148d、n149i、m153t、v163a
EBFP F64L,S65T,Y66H,Y145F

表2:GFP衍生物中特定突变的功能作用

突变 已知函数
S65T 增加了荧光,光稳定性,并将主激发峰移至488 nm
F64L. 提高折叠效率37摄氏度
Y66W 使发色团形成吲哚而不是苯酚组分(青色衍生物)
Y66H 波长蓝移(蓝色导数)
Y145F. 增加BFP的量子产量
Y145A和H148D 稳定结构天蓝色的衍生品
F99S、M153T V163A 在37℃下改善折叠,减少高浓度的聚集
T203Y. 红移波长(黄色衍生物)
A206K 干扰二聚体界面(单体衍生物)
K26R, Q80R, N146H, H231L(可能其他) 中性突变

多种应用

由于其尺寸和易用性,GFP和其他荧光蛋白已成为分子生物学的主干。vwin德赢娱乐平台科学家们可以很容易地利用含GFP的质粒作为许多功能末端的手段。我们列出了我们的收藏夹,但目前存在的许多其他用途,并且不断开发新的GFP技术!

  • 融合标记:最常见的用途之一是,GFP可以与蛋白质的N-或c -端融合,这使科学家能够可视化基因何时何地表达。点击这里查看Addgene用于构建荧光融合的空白骨架的收集。

  • 转录记者:将GFP置于目标启动子的控制下,可以有效地监测特定细胞类型中该启动子的基因表达。这种类型的转录报告是GFP最早的应用之一。

  • Förster共振能量转移(FRET):这是用来研究两个蛋白质之间的相互作用或两个域之间的蛋白质经历构象变化。通常使用两个具有重叠的激发/vwin德赢娱乐平台发射光谱的荧光蛋白;一个融合到每一个被测试的蛋白质或结构域。在这里发现褶皱质粒。

  • 拆分EGFP:作为FRET的替代品,分裂EGFP也被用来研究蛋白质间的相互作用。在这种情况下,EGFP的两部分与目标蛋白融合,当它们接近时,EGFP的两半会发生折叠、成熟和荧光。

  • 生物传感器:设计了各种基于GFP的荧光生物传感器,用于检测各种细胞内条件,包括离子(如CA2 +)浓度和pH,使用一系列策略,如褶皱,钙调蛋白和其他策略。审查Addgene的荧光生物传感器的集合在这里。

  • 光遗传学:科学家可以使用光来检测,测量和控制分子信号,细胞和细胞组,以便理解其活动并可视化改变对该活动的影响。更多关于OpenOptoOnicics的Optimetics了解更多信息在addgene找到Optogeneic执行器和传感器。

  • 细胞标记/选择:类似质粒的表达结构通常包括GFP作为标记,以帮助识别哪些细胞成功地吸收了质粒。这可以作为抗生素选择的替代品。这种类型的质粒可能在目标基因的另一个启动子的控制下,或在目标基因的同一转录本中表达,但在一个内部核糖体进入位点(IRES)之后。这通常与FACS一起使用(见下文)。

  • 荧光激活细胞分选(FACS):这是一种流式细胞术,其将细胞的混合物分成基于荧光信号的不同群体。因此,FACS可以用于将表达GFP的细胞与不是的细胞分离。

  • 发展/转基因用途:由于其稳定性,GFP可用于细胞命运研究中的谱系跟踪能力。当在感兴趣的促进剂控制时,也可以使用它,以可视化这些启动子活性的发育阶段。此外,GFP可以标记转基因改性的ES细胞,然后可以用于植入和产生转基因小鼠的产生。

  • 净化:GFP可用作蛋白质纯化的一般表位标签,并​​且可以使用许多商业抗体可获得GFP。

  • 其他:我们真的只是划伤了GFP潜在应用的表面。它还用于鉴定药物筛中的特定细胞群,以使裸体小鼠中的裸体小鼠在癌症研究中可视化,作为DNA双链断裂修复的记者,并标记病原细胞内微生物以可视化宿主/病原体相互作用。

你有最喜欢的使用GFP的方式吗?请评论并告诉我们怎么做!

下周回来届时我们将会邀请到一篇来自Gal Haimovich的客座博客greenfluorescentblog。盖尔会分享他的名单选择最佳荧光蛋白时要记住的10件事在你即将进行的实验中使用。与此同时,如果你还没有看过盖尔的博客,你应该看看!他有很多关于荧光显微镜最新工具和技术的文章和见解。

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注:A. Max Juchheim对本文的写作有贡献。

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