质粒101:如何用限制性酶切分析验证质粒

由Lianna Swanson

DNA

恭喜你,你有一个表达你感兴趣的基因(YGOI)的质粒,并准备好进入你的功能实验!无论你是自己克隆了这个质粒,还是从同事那里获得的,花点时间来确认你所使用的是正确的结构,并验证你得到的质粒与预期的序列相匹配,总是一个好主意。在Addgene,我们使用NGS-based质量控制确认我们分配的所有质粒的序列。这种方法是费时的,所以我们推荐一种多种筛选和验证质粒的方法。在这里,我们将介绍限制摘要分析。

诊断限制消化

诊断酶切可用于确定质粒的大致结构,基于预测的大小和组织不同的特性在质粒中。即使没有完整的质粒序列,限制性分析也可以成功使用。一旦你纯化了质粒DNA,这种方法可以在你的实验室里在不到一天的时间内完成。诊断限制酶切包括2个单独的步骤:1)培养你的DNA与限制性内切酶在特定的位点,DNA分子和2)运行琼脂糖凝胶反应,以确定产生的DNA片段的相对大小。

限制酶切通常被用来确定插入物的存在在一个特定的载体中,通过切除插入物从脊柱。要做到这一点,你需要使用在插入物侧面有限制性位点的酶。你需要知道两者的大致大小向量骨干以及预测的插入尺寸。你可以搜索NCBI以便YGOI在必要时找到特定的参考序列。

质粒图的限制性消化凝胶右边的质粒样本总大小为7.3kb,包括一个1.2 kb的插入片段。质粒用两种独特的酶消化(HindIII和BamHI)用琼脂糖凝胶。得到的凝胶图像包括一个1kb的阶梯(第1道),其条带范围从500bp到10kb, 3.0kb的片段强度增加,作为参考条带。未切割的DNA(2道)显示了3种可能的质粒构象,带有松弛和用星号(*)标记的缺口。当质粒被两种酶消化时印度语和孟加拉语(4-5系),有一个7.3 KB的条带代表了质粒的完整大小。用HindIII和BamHI (lane 3)进行的双酶切分别产生6kb和1.2kb的条带(红框),分别与主干和插入相匹配。凝胶的计算结果与预测尺寸相符。

观看这段视频,快速了解如何分析限制摘要:

限制文摘的提示和技巧:

下面的技巧将使您更容易获得有用且信息丰富的诊断限制摘要。

对你的消化:

  • 尝试选择独特的酶。只切割一次的酶可以让你更容易和准确地看到你的构造的完整大小。

  • 考虑缓冲和温度兼容性当用一种以上的酶消化时。请参考制造商手册以获得最佳工作条件每个酶

  • 注意甲基化问题。像XbaI和ClaI这样的酶对甲基化很敏感,它们的活性可能被阻断。如果你必须使用这些酶来消化,你将需要从dcm或dam甲基化缺陷菌株(如JM110或INV110)中纯化你的DNA。

  • 避免明星活动。一些内切酶(例如BamHI)能够切割与其定义的识别序列相似但不相同的序列。大多数酶制造商生产高保真版本的内切酶和/或提供自定义缓冲,以避免这个问题。

为你的凝胶:

  • 在倒入凝胶之前加入溴化乙锭(EtBr)。EtBr与DNA结合,可以让你在紫外线(UV)下看到DNA。

  • 不要忘记在加载消化反应之前添加加载缓冲。缓冲液中的甘油将确保你的样品在凝胶中安定良好,染料提供了一个直观的参考点,所以你可以很容易地评估凝胶已经跑了多远。奖金:染料也以预测大小运行所以你可以根据染色剂来估计你的橡皮筋走了多远!

  • 永远要爬梯子。梯子可以让你解释你在样本车道上得到的波段。根据预期的频带大小选择您的阶梯。

  • 始终运行控制未切割的DNA,以确保您的酶工作。当未切割的质粒DNA被分离出来并在琼脂糖凝胶上运行时,你可能会看到3条条带。这是由于环状DNA具有最丰富的几种构象:超卷曲、松弛和断裂。如果你的消化车道看起来像你的未切割的车道,那么一定有什么问题!

  • 量化你的DNA。携带太多的DNA将使其难以获得脆带和分析结果。奖金:知道你在每口井里装了多少DNA就能让你近似DNA质量类似大小的比较密集的样本。

  • 在80-150V的电压下运行凝胶,直到你的带子之间有很好的分离。停止凝胶时,溴酚蓝染料线大约是75-80%的凝胶将确保你保持较小的条带从流失;然而,你可能需要运行凝胶较长时间,以实现良好的分离较大的DNA片段。

我希望这些技巧能够证明质粒验证不仅是必要的,而且是一个简单的过程。请访问Addgene的质粒验证资源以找到关于诸如如何设置您的摘要倒出/检测DNA凝胶


更多质粒教育资源:


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主题:质粒101,分子生物学协议和提示,质粒

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