质粒101:敲除/敲击质粒

由Benoit Giquel.

研究基因功能最强大的策略之一是通过用在实验室中的DNA替换或破坏它来灭活或“淘汰”,基因。专门构造的质粒可用于替代酵母,小鼠或果蝇通过同源重组。该概念很简单:将模板提供给靶序列的修改版本,细胞将与内源基因重新组合模板。在这里,我们将描述用于在哺乳动物细胞中灭活特异性基因的技术和质粒。尽管受欢迎基于CRISPR的淘汰赛/敲门系统,这些系统仍然有价值,特别是在不能使用CRISPR的情况下(例如,附近没有合适的PAM序列或者您的感兴趣的基因难以专门用GRNA靶向)。在选择淘汰赛策略时务必记住这些技术!

敲除质粒

同源重组是准确修复有害双链破裂的机制,其中核苷酸序列在两个类似或相同的DNA分子之间交换。基因靶向利用这种自然过程,用特殊设计的载体用同源序列替换靶向遗传基因座,该载体含有序列同源与感兴趣的轨迹。为了让您了解过程,我们将通过一个设计用于击出给定基因的外显子2的实验。敲除定位构建的地图

  1. 设计目标构造。为了在电池中发生重组,需要至少2kb的序列同源性,但是对于靶向构建体,6至14kb的同源性是典型的。在图1所示的示例中,对应于目标基因的外显子1和3的大序列已被克隆到载体上的载体上抗生素抗性基因。为了避免选择构建体随机整合到基因组中的细胞,在伴随的同源臂之外包括HSV胸苷激酶(HSV-TK)等负选择标记。当我们稍后选择细胞时,我们将首先对抗生素抗性基因进行阳性选择,然后对负选择标记进行计数器选择 - 当后一步将杀死许多随机整合质粒的全部或大部分的许多细胞。
  2. 将您的构建传递给目标细胞。重组后,靶向基因的外显子2将从染色体中除去并被抗性基因取代。因此,基因被破坏或敲除。
  3. 使用正面和否定选择来找到正确的重组细胞。重组是一种罕见的事件,因此您必须选择相反的是对发生重组的细胞屏幕。新霉素,嘌呤霉素和潮霉素抗性基因通常用于阳性选择。虽然阳性选择标记选择重组,但是负选择标记选择反对不当,随机重组到不同的基因座中。正确的重组细胞不会含有阴性选择标记,但具有随机重组的细胞可以将阴性选择标记包含到基因组中。这种非同源重组的最终产物可以存活阳性选择,但它对阴性选择敏感。
  4. 删除正选择标记。由于抗生素抗性基因可以影响细胞的表型,因此研究人员通常在选择后将其除去CRE / LOX重组系统。通过插入侧翼LOXP序列“熔化”抗性基因后,可以通过添加CRE重组酶去除基因(图2)。
CRE构建

敲除/敲击质粒

基因靶向方法还可以将其插入或敲入任何基因,标签或突变的外显子进入基因组。为此目的,将要插入的序列与阳性选择标记一起克隆到同源序列之间的载体中。为了淘汰给定的基因和插入物GFP.进入基因组,我们创造了类似于下面所示的质粒,其中GFP的序列与靶向基因的外显子1和3之间的新霉素抗性(Neor)基因一起克隆。重组后,GFP / Neor插入盒子以代替外显子2.因此,靶向基因被破坏(敲除),但表达了插入的GFP(敲入)。如上所述,使用CRE重组酶可以去除碳抗性基因。如果GFP受到内源启动子的控制,则可以使用表达GFP跟踪参与所选择的启动子应对的开发或其他生理病理事件的细胞。您还可以使用这种方法用GFP标记内源性蛋白质,如蓝色火焰质粒所示Oct4-EGFP-PGK-PURO来自Jaenisch Lab.

GFP瞄准构造

有条件的淘汰赛

前一节中描述的方法和质粒是敲出感兴趣的非必要基因的简单方法。但是,如果您的目标基因是必不可少的,则真正的敲除可以是致命的,而且您将想创建一个有条件的淘汰赛

为了使条件淘汰,研究人员通常使用前面描述的CRE / LOX系统。在这种情况下,您设计了目标载体,使得一组三个LOXP位点在感兴趣的基因中侧翼和靶向外显子(图4)。当发生重组时,基因仍然正常运作,因为其外显子之一简单地被Loxp位点侧翼的相同序列替换,而抵抗盒已被放入内含子中。

条件等位基因构建

发生重组后,首先使用CRE重组酶去除阻力标记。由于存在3个LOXP网站,因此可以多种方式发生重组。所需的重组事件将仅移除NeOR并离开外显子2浮动,如图4的第4行所示。由于LOXP位点位于内肾区中,因此该基因仍将表达。使用PCR,首先筛选这种特定的重组结果,然后用浮动外显子产生单克隆细胞系。然后,您可以通过第二轮CRE重组将此外显子(并因此敲出基因)。

淘汰质粒的未来

虽然这些方法已被用于创造许多敲除细胞系和动物模型,但它们的效率非常低,从未检测到0.1%。相反,新的基因组编辑技术,如CRISPR更容易使用并且在灭活基因时更有效。CRISPR可以靶向基因组序列并使用修复模板通过同源重组修复的突破。这些模板可以包括要创建的Loxp站点条件浮动等位基因。虽然CRISPR非常擅长制作淘汰赛,但敲门大部分DNA可能会更加困难。加载储量器已开发出新的CRISPR-SITE的方法,以便我们讨论的各种敲扣CRISPR 101电子书

很难相信第一个基因敲除小鼠诞生于1989年,不到30年前。随着传统的敲除和新的CRISPR工具的不断完善,细胞和小鼠敲除系的产量应该会增加。新的基因组工程工具也为创建新的基因敲除动物模型提供了希望,这些动物以前很难被改造,比如老鼠。如果你有工具来创建敲除动物或细胞系,请考虑通过保存与Addgene共享它们!


数据改编自:B,Limaye,&Ab Kulkarni。(2009)“概述:基因敲除小鼠的生成”。Curr Protoc细胞Biol。19:1217. PUBMEDPMID:19731224pmed中央PMCID:PMC2782548

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