vwin德赢娱乐平台荧光蛋白101:荧光素酶

作者:jason niehaus.

杰森Niehaus

植物上的萤火虫荧光素酶是一类能够催化生物体中的化学反应的酶,导致光子的发射。大多数人最熟悉的生物发光生物是萤火虫(Photinus pyralis),也许这并不奇怪,它也是最常用的生物发光报告。这种甲虫发出黄绿色的光,峰值发射波长为560nm。后不久初始文章描述萤火虫荧光素酶的克隆于1985年公布,几项研究利用荧光素酶作为植物和哺乳动物细胞的遗传报告。荧光素酶测定以来已成为基因表达分析中的金标准和a荧光素酶基因(许多可供选择的之一)现在是报告质粒的一个常见特征。

了解荧光素酶如何与荧光蛋白在纳米灯笼中协同使用

记者基因测定

报告基因,如荧光素酶,通常作为一个转录指标在细胞内,检测报告蛋白或其酶活性的测量。启动子或增强子区域对基因表达的影响可以通过在特定的检测中检测报告子来确定,理想的方法是低背景信号,高灵敏度,当然是快速、准确和安全的。在荧光素酶分析的情况下,光子发射是由需要荧光素、ATP和氧气作为底物的化学反应催化产生的。由这种生物发光报告物产生的光子比基于荧光的方法发生得慢,如激发绿色荧光蛋白(GFP)因为与使用高强度激光快速激发绿色荧光蛋白相比,化学反应的本质是不同的。由于产生光子的不同机制的结果,化学发光报告者通常不那么亮vwin德赢娱乐平台,但具有较低的本底电平和提高信号灵敏度的优点,因为光子的测量很简单- - - - - -不需要它们来引发反应。表1比较了发光与荧光的一些普遍优点和缺点

表1:发光性与荧光的性质

发光 荧光
发射光子源 化学反应 高能光子
光子产生动力学 慢点
Cofactors /基板 必需的 不是必需的
信号强度 较低的 更高
灵敏度 更高 较低的
背景 较低的 更高
翻译修饰 不是必需的 必需的
光漂白/光毒性 不容易受到影响 易受影响的
亚细胞成像 改善 完善的
高通量测定 改善 完善的

荧光素酶的生物来源

海三色堇虽然从萤火虫甲虫中分离出的荧光素酶(Photinus pyralis)是最常用的生物发光报道器,其他荧光素酶已经以不同的动力学,基板要求和光子发射波长鉴定出各种物种。Renilla海三色堇荧光素酶(Renilla eniformis.)在与底物coelenterazine催化化学反应时,发出480nm的蓝光,可能是第二常用的荧光素酶。其他可以克隆出荧光素酶的生物包括滴答虫(自然物plagiophthalmus)、铁路虫(Phroxothrix Hirtus.),以及各种海洋甲壳类动物。这些荧光素酶中的许多已经被进一步的工程,以改善其性质的天然酶,总结在表2在下面。

表2:天然荧光素酶的性质

生物 峰发射(NM) 尺寸(KDA) 基质 Cofactors. 分泌
发光虾
(Oplophorus gracilirostris.)
455. 19 Coelenterazine. 没有任何 是的
发光的日本介形亚纲动物
(Cypridina夜光虫)
海上萤火虫
(Cypridina Hilgendorfii.)
465. 62 Cypridina (Vargulin)荧光素 没有任何 是的
海三色堇
(Renilla eniformis.)
480 36 Coelenterazine. 没有任何
深海coceopod
(高斯普林斯)
480 20. Coelenterazine. 没有任何 是的
Metridia隆 480 24 Coelenterazine. 没有任何 是的
北美萤火虫
(Photinus pyralis)
560. 61 荧光素 三磷酸腺苷
日本的萤火虫
(Luciola Cruciate / lateralis)
意大利的萤火虫
(Luciola Italica.)
俄罗斯南部萤火虫
(Luciola mingrelica)
562. 64 荧光素 三磷酸腺苷
牙买加磕头虫
(Pyrophorus plagiophthalamus)
544 - 593 64 荧光素 三磷酸腺苷
铁路蠕虫
(Phroxothrix Hirtus.)
630 64 荧光素 三磷酸腺苷

表达荧光素酶质粒的常见用途

Luciferase报告器测定

典型的含荧光素酶质粒最常用于调查调节元件,例如促进剂,增强剂和未翻译的地区的影响,或这些调节元素对基因表达的突变的影响。调节元素(野生型或突变体)在质粒中的荧光素酶基因的上游克隆,然后将其引入所需的哺乳动物,植物或者细菌细胞。荧光素酶作为报告基因的表达通过其活性测量以产生光,通常用发光计或闪烁计数器,然后可以使用活性测量来量化调节元件的作用。取决于所用的特定荧光素酶,必须为酶提供相容的基材以催化发光反应。许多荧光素酶测定需要细胞裂解作为破坏细胞膜并递送基材的最有效的方法;然而,分泌的荧光素酶或替代衬底试剂的使用可以允许测量来自活细胞的发光。

监控miRNA敲低

荧光素酶的表达可以被监测为靶序列对miRNA效率的下游测量。感兴趣的基因是克隆到质粒含有止芯密码子的荧光素酶的下游,然后将其转染到所需的细胞中。含有荧光素酶的杂交mRNA转录物和感兴趣的基因允许函数荧光素酶的翻译,直至miRNA靶并降解mRNA序列,导致荧光素酶活性降低。该实验方案可以容易地筛选miRNA以获得有效性。

分析细胞信号传导途径

已知的细胞信号通路可以通过高通量筛选来研究,使用荧光素酶活性作为信号活性的测量。多个响应元件被克隆到与荧光素酶连接的最小启动子上游的质粒中。激活该途径将导致荧光素酶的表达,可以设计更复杂的细胞治疗来进一步探索该途径。

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