质粒101:多顺反子载体

由Melina Fan.

美琳娜迷

双顺列基因多个基因的共同表达在许多实验设置中是有价值的。为了实现这一目标,科学家们使用了多种技术,包括共转染两个或多个质粒,使用多个或双向启动子,或创造双顺反子或多顺反子载体。与启动子不同的是,多顺反子载体同时表达来自同一mRNA的两种或多种不同的蛋白质。启动子会为所表达的每个基因创造独特的mRNA转录本。我们已经讨论了启动子在此之前,我们将介绍多顺反子向量的基础知识:它们为什么有用,它们如何工作,以及如何开始使用它们。

为什么要使用多时调制载体?

检测表达你的基因的细胞,特别是当你在研究一个新基因时,并不总是一个简单的过程。科学家们不是试图直接检测你感兴趣的基因,而是开发了新的方法来与报告者共同表达你的基因,比如荧光基因或抗性基因。这些报告者允许您轻松地筛选或选择细胞表达您感兴趣的基因在高水平。不同于从一个独特的启动子中表达可筛选或可选择标记的载体,多顺反子质粒确保任何标记阳性的细胞也应该表达你的基因,因为它们都来自同一个转录本。

当然,多时调制载体不必专门用作检测手段;几乎在您希望在同一单元格中表达多个基因时几乎是有用的。尽管可以通过使用具有多个单独表达盒的质粒来驱动共表达,但是从相同的盒式磁带表达的基因有时是有利的,特别是当仅包装一部分质粒时病毒交付或两种或更多种基因之间的相对表达水平很重要。

多时调制矢量如何工作?

科学家们“借来”在正链RNA病毒中发现的一些技巧,以允许从单个转录物中有效翻译多种基因。下面描述最广泛地掺入质粒中的两种策略。

IRES元素

真核生物的转译通常从5 '端开始,因此每个mRNA只有一个转译事件发生。然而,一些双反子载体利用一种称为内部核糖体进入位点(IRES)的元素,允许从mRNA的内部区域开始翻译。

bicistronic_vector

在上图中,你可以看到IRES元件作为另一个核糖体招募位点,从而导致来自单个mRNA的两种蛋白质的共同表达。

IRES最初是在脊髓灰质炎病毒RNA中发现的,它促进真核细胞中病毒基因组的翻译。1,2从那时起,已经发现了各种IRES序列 - 许多来自病毒,而且来自蜂窝MRNA。他们都有共同之处的是能够引发翻译启动的能力,与5'帽无关。

IRES元素非常有用,常见于双顺列载体;但是,他们确实有一些缺点。这些元素非常大(500-600 BP),可以在有限的包装能力中占据病毒转移向量的宝贵空间。另外,使用IRES元件表达多于两个基因可能是不可行的。此外,由于诸如实验细胞类型等因素和克隆到载体中的特定基因,科学家们报道了下游Cistron的表达下降。3.

2肽

为了克服IRES元素的一些缺点,科学家们将“自切割”2a肽改编成其判定的反拨载体。这些肽,首先发现了小核糖核酸病毒,是短(约20个氨基酸),并产生来自相同mRNA的等摩尔水平的多摩尔水平。术语“自切割”并不完全准确,因为这些肽被认为是通过制造的核糖体在2a元素的C末端跳过合成肽键,导致在2A序列的末端和下游的下游肽之间分离。4“切割”发生在c端的甘氨酸和脯氨酸残基之间,这意味着上游顺反子将有一些额外的残基添加到末端,而下游顺反子将从脯氨酸开始。

下表列出了科学家常用的四种2A肽。2A分裂在真核细胞中是普遍存在的,尽管一些科学家报告其中一些肽的分裂接近100%,但对于哪一种肽的效果最好还没有达成共识。具体的2A肽的选择可能最终取决于许多因素,如细胞类型或实验条件。

氨基酸序列*
T2A: (GSG)e g r g s l t c g d v e n p g p
P2A: (GSG)a t n f s l l k q a g d v e n p g p
E2A: (GSG)Q c t n y a l l k l a g d v e s n p g p
F2A: (GSG)v k q t n f d l l l a a g d v e s n p g p

* (GSG)残基可以添加到肽的5'端,以提高肽的切割效率。

我该如何开始?

如果你想与荧光蛋白或可选标记物共同表达你感兴趣的基因,最简单的方法是从已经克隆了多顺反子元件和报告子的质粒开始。在这些质粒中,你只需将你感兴趣的基因克隆到IRES或2A元件上游或下游的多个克隆位点(取决于报告基因的位置)。

Addgene的集合提供了多种表达两个或更多基因的质粒,下面列出了其中一些。我们应该注意tHESE vectors主要是为双顺列表达设计的;然而,许多人可以容易地操纵以表达超过两个基因。

质粒名称 多时钟元素 表达式类型
MSCV-IRES-EGFP 爱好者 逆转录病毒
PMSCV-PBABEMCS-IRES-RFP 爱好者 逆转录病毒
PMSCV-IRES-YFP II 爱好者 逆转录病毒
pCMMP-MCS-IRES-Puro 爱好者 逆转录病毒
pEF1a-IRES-Neo 爱好者 哺乳动物
MSCV-IRES-Luciferase 爱好者 逆转录病毒
pWPI 爱好者 慢病毒
Amcyan-P2A-MCHERRY P2A 哺乳动物
pC5Kan-P2A P2A 昆虫
pUltra P2A和T2A 慢病毒
Ac5-STABLE2-neo T2A. 昆虫

对于多个独特基因的共表达,你可以从一个在多顺反子元件两侧有多个克隆位点的质粒开始,或者你可以用你的基因或感兴趣的基因替换上面的报告基因中的一个。上表中列出的一些质粒(及其相关质粒)被设计成具有一个或多个更换的基因。

此外,2A肽可以通过pcr在你感兴趣的基因之间克隆,然后你可以将整个多顺反子盒作为一个单个单元插入主干中。虽然我当需要时,建议使用2A肽而不是IRES,而是需要在化学计量等同的表达水平时,We还应注意,IRE和2A肽不是相互排斥的元素。实验室已成功使用同一多调整载体中的2A和IRES元素,有效地制作在IRES荧光报告器上游的等效水平表达多个独特基因的构建体,以便于检测。5

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引用:

1.通过衍生自脊髓灰质炎病毒RNA的序列的真核mRNA翻译的内部开始。Pelletier等人(性质。1988年7月28日; 334(6180):320-5。)PubMed

2.在体外翻译过程中,脑心肌炎病毒RNA的5'非翻译区引导核糖体内部进入。Jang等人(J病毒。1988年8月; 62(8):2636-43。)PubMed

3.肽2A序列高效多顺反子慢病毒载体。vwin668易卜拉欣等人(嗡嗡声基因。2009年8月,20(8):845 - 60。doi: 10.1089 / hum.2008.188。)PubMed

4.从猪teschovirus-1中提取的2A肽在人类细胞系、斑马鱼和小鼠中的高切割效率。Kim等人(Plos一个。2011; 6(4):E18556。DOI:10.1371 / journal.pone.0018556。EPUB 2011年4月29日。)PubMed

5.由T细胞抗原受体cd3 ITAMs介导的可扩展信号传导确保了有效的阴性选择和防止自身免疫。Holst等(Nat Immunol. 2008 6月;9(6):658-66。doi: 10.1038 / ni.1611。2008年5月11日。)PubMed

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