质粒101：质粒克隆中使用的筛选策略

如果你克隆一个质粒，你需要一种方法来找到大海捞针:从许多不含质粒的细胞中找到一个包含质粒的完美克隆。开始研究的一种方法是使用选择策略，只有获得或失去特定基因的细胞存活下来(例如:抗生素抗性标记）。在以前的博客文章中，我们涵盖了如何使用质粒克隆的正负选择。

但是，常时，选择策略是不够自己的，以帮助您找到所需的质粒。在许多情况下，您也需要一个筛选策略。在屏幕中，您并没有像在选择中一样杀掉一部分细胞。相反，所有细胞存活，您需要对它们进行排序以找到所需的克隆。

做你的选择，然后屏幕

为什么为您的克隆策略添加屏幕？屏幕将帮助您更轻松地识别成功的克隆，因此您必须在实验后通过更少的殖民地杂草。作为一个常见的例子，选择将使您含有含有质粒骨干的菌落，因为它通常依赖于抗生素抗性。但识别包含所需插入件的克隆怎么样？这是屏幕进入的地方。

让我们来看看ALL_IN_ONE_CRISPR / CAS9_LACZ.， CRISPR gRNA质粒来自Lynne Postovit的实验室。它的主干中含有一个氨苄青霉素抗性标记物。在含有氨苄青霉素的琼脂上进行选择，会产生占用这个载体的细菌，但它不会告诉你这个载体是否包含gRNA插入物。然而，一个蓝白色的屏幕可以提供这些信息(下面有更多关于这方面的信息)。将转化膜放在含有X-gal的氨苄西林平板上，可以识别携带载体的细胞，并区分携带gRNA的质粒(白色)和不携带gRNA的质粒(蓝色)。

让我们来看看一些筛选方法。

蓝白色的屏幕

广泛使用的筛选方法是蓝白屏幕，其依赖于lacZ基因。lacZ编码能水解乳糖的半乳糖苷酶。幸运的是，对于实验室研究人员来说，当底物X-gal被-半乳糖苷酶分解时，它就变成了一种不溶性的蓝色色素。

在Addgene中查找用于蓝白筛选的质粒！

一些细菌菌株含有lacZ在他们的基因组中，科学家们发现当缺失一部分基因时，它产生非功能性 - 高烷基酶。通过表达该缺失部分，例如在质粒上，通过表达该突变产生官能团 - 高分子酶。蓝白色屏幕依赖于感兴趣的基因插入中间的载体lacZ基因，从而破坏 - 溶解酶活性。这些细胞，大概是所需的细胞，不能分解X-gal，是白色的。不包含插入件的单元格是蓝色的。看看我们的蓝白筛选博客帖子有关更多信息。

图1：蓝白屏幕的结果。图片来自Stefan Walkowski.。

限制消化

区分含有质粒的菌落的菌落的另一种方法是从不使用的插入物限制性消化。关键是要有策略地选择你的酶。你会想要选择不同大小的酶根据质粒是否包含感兴趣的插入物。例如，选择在期望插入物的两边只切一次的酶。如果质粒包含插入物，你会看到两条带:一条代表载体主干，另一条代表插入物。如果质粒不包含插入物，你只会看到载体主链。或者，你可以选择一种酶在质粒主链中进行一次剪切，另一种酶在插入物中进行剪切。如果质粒含有插入物，你会看到两条条带，但如果质粒没有，你只会看到一条。这些只是你如何使用限制消化筛选你的克隆的几个例子，但是有许多其他的方法选择限制酶的这种方法。

如果您计划进入这条路线，请在使用限制摘要中查看我们的协议视频以分析质粒，这可以帮助您可视化此过程，或访问我们的限制分析博客文章。

菌落PCR

菌落PCR可以检测DNA的存在或缺失使用裂解菌落，而不需要准备您的质粒。在这种情况下，你可以使用菌落PCR来检测插入物，或者使用对插入物有特异性的引物，或者使用对载体有特异性的引物，但可以放大潜在的插入物。如果你使用插入物特异性引物，如果质粒包含插入物，你应该期待一个PCR产物，如果质粒不包含插入物，则没有PCR产物。如果你用的是载体特异性引物，寻找大小差异。你也可以使用引物，其中一个引物退火到插入和其他引物退火到主干。在这种情况下，如果质粒中没有插入物，你就不能扩增任何东西。就像任何实验一样，你需要正确的PCR阳性和阴性对照。

找到详细信息并了解更多信息菌落聚合酶链反应。

图2:菌落PCR步骤。

Sanger测序

Sanger测序确定DNA分子内核苷酸的精确顺序，在这种情况下是质粒。测序是最明确的方法之一，即知道您的插入是您所期望的。要开始，您将首先需要一个底漆来补充你的质粒序列。从一个骨干的特定于骨干的底漆开始，该底漆将在多个克隆站点（MCS）上序列并进入您的插入物。看看我们的矢量数据库寻找更常用的骨干网和特定引物的质粒图，您可以用来确认克隆。您也可以找到列表受欢迎的测序引物在我们的分子生物学参考。

有时，常见的底漆无法提供您需要的所有信息，因此您需要设计自定义底漆。由于Sanger测序通常可以序列仅为1kB的DNA，所以定制引物特别有助于通过从末端测序来验证不达到的突变。想知道更多？访问此博客文章分析和排除Sanger测序结果的提示。

在Addgene，我们现在使用我们的QC过程中的下一代测序。这样，我们可以确认整个质粒的序列。请注意，NGS验证比Sanger测序或上述其他技术更加冗余。

在分子生物学中，将一个基因克隆到质粒中通常是一个数字游戏。通过使用各种筛选和选择技术，你可以增加找到正确克隆的机会。

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