质粒101:质粒克隆的阳性和阴性选择

詹妮弗德赢在线曾

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你努力工作纯化您的感兴趣的基因把它进入你的质粒骨干, 和Zap将DNA的混合物纳入细胞。不幸的是,并非每种细胞都成功占用质粒DNA。在那些那样的中,有些现在有含有你感兴趣的基因的质粒,但其他人将吸收重新连接的质粒骨架。

因此,你的克隆策略需要鉴定您正在寻求的质粒构建体的细胞。幸运的是,有很多方法可以做到这一点涉及正面选择,负面选择和/或筛选。我们在这个博客帖子中专注于积极和否定的选择,但别担心,我们将在未来的帖子中覆盖屏幕。

细菌克隆选择策略选择仅含有质粒的克隆

阳性选择:获得特定基因的细胞存活

在阳性选择中,只有含有特定基因的细胞存活。其余的不生长。虽然有很多方法来设计你的积极选择策略,但这里有一些需要考虑。

抗生素选择

在插入的DNA包括抗生素抗性标记物的情况下,选择是简单的。后转型,在含有相应抗生素的培养基上粘在培养基上。例如,如果您插入质粒骨架中的DNA含有卡霉素抵抗盒,则您将在含卡霉素的琼脂上铺板细胞。只有携带含有卡那霉素抵抗盒的质粒的细胞将生长。

然而,通常是时候,质粒骨架包括抗生素抗性盒,并且您并未引入额外的抗生素抗性盒以及您的目标基因。在这些情况下,抗生素选择将选择用质粒骨架(有或没有插入的DNA)转化的细胞,并且进一步的筛选将有助于您确定质粒骨架是否含有感兴趣的基因。

营养营养素

除了抗生素选择外,您可以通过利用诸如肌醇等细菌特征,合成生长所需的所有化合物的能力,能够合成生长所需的化合物的所有化合物来选择感兴趣的DNA。

营养营养素and prototrophy come into play during cloning if you’ve designed your experiment using an auxotrophic strain of bacteria (one that doesn’t synthesize an essential amino acid), and a plasmid that complements the auxotrophy (i.e., synthesizes the critical amino acid). Many常见的E.科利菌株用于克隆是特定氨基酸的氛围。当涂覆缺乏必需氨基酸的培养基时,如果它获得含有合成缺失氨基酸所需的基因的质粒,则只会生长细菌。

营养营养选择通常用于克隆以来在酵母中自发地发生抗生素抗性。例如,Markus Ralser.实验室创造了一个酵母原型试剂盒含有23个质粒以补充浮子养殖。

阴性选择:丢失特定基因的细胞存活

与阳性选择不同,负选择意味着您选择损失基因产品 - 通常有毒。该基因在原始质粒上发现,并且在基因内插入DNA片段或基因的丧失减轻了其毒性作用。否定选择有时被称为计数器。

毒素 - 抗毒素系统

一个否定选择策略使用毒素CCDB.网关克隆通过包括包括此属性的利用CCDB.在目的地质粒上。在目的地质粒中,CCDB.基因是重组位点的侧翼。为了引入目的地质粒进入目的地质粒的基因,必须首先加入重组位点以侧翼该基因。成功的重组和对质粒中这些位点的感兴趣基因的整合突出了CCDB.基因和细胞只会在含有感兴趣的基因中生长。

SACB反选择

SACB反选择依赖于SACB基因产生的有毒产物。来自革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌并编码酶Levansucrase,其将蔗糖转化为革兰氏阴性细菌的毒性代谢物。蔗糖培养基上的镀层将选择含有丢失的构建体的细胞基因。

SACB可以与CCDB类似地使用。例如,在基因表达质粒中PGTVL1-SGC.Nicola Burgess-Brown的实验室, 这基因用于5%蔗糖板上的阴性选择。交换感兴趣基因的基因允许细菌在蔗糖上生长。

质粒克隆:具有天然存在的基因的创造力

此时,您可能已经意识到阳性和负选择策略采用天然存在的基因,用于克隆目的(抗生素抗性基因,毒素基因和基因)。通过进入大自然的工具箱,科学家正在寻找越来越多的方式来在质粒克隆中创造性地进行选择。

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