质粒101:蛋白质表达

由Alyssa Cecchetelli.

分子生物学中的中央教条是DNA→RNA→蛋白质。为了合成特定的蛋白质DNA必须首先转录成信使RNA(mRNA)。然后可以将mRNA在核糖体中翻译成构成蛋白质的主要结构的多肽链。然后通过包括蛋白质折叠的蛋白质折叠,形成二硫化物桥,糖基化和乙酰化以产生功能性,稳定的蛋白质的阵列进行修饰大多数蛋白质。蛋白质表达是指该过程的第二步:从mRNA合成蛋白质和添加后翻版后修饰

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研究人员使用各种技术来控制实验,生物技术和医疗应用的蛋白质表达。研究可以想象蛋白质在活的有机体内通过标记它们vwin德赢娱乐平台研究定位或纯化蛋白质以研究它们的结构,相互作用和功能。也可以纯化蛋白质以用于分子生物学研究(例如,可以纯化聚合酶和其他酶并用于操纵DNA),或在医学中(例如胰岛素)。

与可以相对容易合成的DNA不同的蛋白质必须使用来自细胞或使用活细胞的复杂混合物来生产。有几种类型的表达系统用于蛋白质产生和纯化。这些包括哺乳动物,昆虫,细菌,植物,酵母和无细胞表达系统。

蛋白质表达过程

总体而言,蛋白质表达的一般策略包括用您的DNA模板转染细胞,并允许这些细胞转录,转化和修饰您的目标蛋白质。然后可以通过使用蛋白质从溶解的细胞中萃取改性蛋白质标签并使用多种净化方法从污染物中分离出来。决定使用哪个表达式系统取决于以下几个因素:

  1. 你想要表达的蛋白质
  2. 你需要多少蛋白质
  3. 您对下游应用程序的计划

在本博客文章中,我们将总结一些更常见的表达系统,包括他们的优势和警告,以便在选择系统之前。

哺乳动物表达系统

哺乳动物细胞是表达哺乳动物蛋白质的理想系统,需要多种翻译后修饰才能正常发挥蛋白质功能。大多数用于哺乳动物表达的DNA构建物利用病毒启动子(SV40、CMV和RSV)进行转染后的稳定表达。哺乳动物系统可以表达瞬时或通过稳定的细胞系表达蛋白质。如果转染成功,两种方法都能产生高蛋白质产量。

当通过使用本构和蛋白质表示蛋白质时,一些哺乳动物系统也允许控制可诱导的启动子。如果所需的蛋白质产物在高浓度下对细胞毒性毒性,诱导型启动子非常有用。尽管他们的优势,与其他系统相比,哺乳动物表达系统确实需要苛刻的细胞培养条件。

昆虫表达系统

昆虫细胞也可用于产生具有正确的翻译后修饰的复杂真核蛋白。有两种类型的昆虫表达系统;杆状病毒感染和非裂谷昆虫细胞。

Baculovirus表达系统对于高水平重组蛋白表达非常强大。这些系统使得高表达非常复杂,糖基化蛋白不能生产大肠杆菌或酵母细胞。杆状病毒系统的唯一问题是感染的宿主细胞最终裂解。细胞裂解停止蛋白质产生,但存在非裂谷昆虫表达系统(SF9,SF21,HI-5细胞),其允许连续表达集成到昆虫细胞基因组中的基因。这两种类型的昆虫表达系统都可以缩放以生产大量蛋白质。

昆虫细胞表达系统的一些缺点包括该病毒产生可以非常耗时,并且昆虫细胞需要类似于哺乳动物表达系统的培养条件。

细菌表达系统

当人们想要快速且廉价地产生大量蛋白质时,细菌宿主细胞几乎总是答案。大肠杆菌绝对是最受欢迎的蛋白质表达宿主之一菌株这是专门用于蛋白质的表达。细菌中的蛋白质表达非常简单;将感兴趣蛋白质的DNA插入到那时的质粒表达载体中转化为细菌细胞。转化细胞繁殖,诱导产生您的蛋白质,然后裂解。然后可以从细胞碎片纯化蛋白质。

有几种流行的DNA载体可用于在细菌细胞中产生大量的蛋白质:例如,PET,PREST,网关PDEST和PBAD载体。来自这些载体中的每一个的蛋白质表达由不同的启动子控制,导致来自每种载体的不同含量的表达;如果蛋白质有毒,可能需要较低的表达大肠杆菌在所有载体中,PET在T7 LAC启动子的控制下并由乳糖诱导,提供最高水平的蛋白质表达。

尽管他们易用,但重要的是要注意细菌通常不能产生功能性多域哺乳动物蛋白,因为细菌细胞没有配备适当的翻译后修饰。此外,细菌产生的许多蛋白质变得不溶,形成难以提取而没有苛刻的试剂和耐心提取的包涵体。

植物表达系统

植物提供重组蛋白质的廉价和低技术的质量表达。许多来自各种类型的植物,如玉米,烟草,水稻,甘蔗,甚至土豆块的植物已经用于蛋白质表达。

植物系统与哺乳动物细胞表达系统共享许多相同的特征和处理要求,包括大多数复杂的翻译后修改。然而,来自植物的重组蛋白的提取和纯化可以是昂贵且植物组织本身在生物化学上复杂的耗时。

为了规避这些问题,科学家通过植物根源利用生化生物化学和蛋白质的自然分泌。用天然分泌的植物肽标记重组蛋白质允许更容易地接近和纯化所需的蛋白质。尽管是一种相当新的技术,但植物细胞已被用于表达各种蛋白质,包括抗体和药物,特别是白细胞介素。

酵母表达系统

酵母是一个能够产生大量真核重组蛋白的伟大表达系统。虽然很多酵母都可以用来表达蛋白质,S. Cerevisiae,由于其用作遗传学和生物化学中的模型生物体,是最可靠和最常使用的物种。

当使用S. Cerevisiae.,研究人员经常在半乳糖诱导型启动子(GAL)的控制下进行重组蛋白质。其他常用的促进剂分别包括磷酸盐和铜诱导的PHO5和杯子启动子。酵母细胞在明确定义的培养基中生长,并且可以容易地适应发酵,从而允许大规模,稳定地产生蛋白质。

一般来说,酵母表达系统比哺乳动物细胞更容易和更便宜,并且通常能够修改复杂的蛋白质不同于细菌系统。然而,酵母细胞的生长速度比细菌细胞慢,生长条件往往需要优化。酵母细胞也以高糖基化蛋白而闻名这取决于你选择的蛋白质。

细胞自由表达系统

在无细胞表达系统中,组装蛋白质在体外使用转录和翻译机械的纯化组分。这些包括核糖体,RNA聚合酶,TRNA,核糖核苷酸和氨基酸。无细胞表达系统是一种在一次反应中快速组装多于一种蛋白质的理想选择。这些系统系统的主要优点是它们能够组装具有标记或改性氨基酸的蛋白质,其可用于不同的下游应用。然而,无细胞表达系统是昂贵的,并且使用非常具有挑战性。


Alyssa爆头Alyssa D. Cecchetelli是Addgene的科学家。她收到了来自东北大学的博士,对细胞信令和沟通特别感兴趣。她喜欢能够帮助科学界共享质粒。


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