质粒101:限制性克隆

由泰勒福特

泰勒福特

当通过限制性内切和连接进行克隆时,你使用限制性内切酶切开一个质粒(主质粒)并插入一个被兼容的限制性内切酶剪切的DNA线性片段(插入片段)。一种酶,DNA连接酶,然后共价结合质粒到新的片段,从而产生一个完整的,环状质粒,可以很容易地在各种生物系统中保持。请继续阅读有关如何执行限制摘要的详细介绍。

限制性酶可以切断你的插入物和载体主干。然后结扎创造你的构念

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在开始限制消化和结扎过程之前,您应该小心选择你的支柱还有插入,这两者都必须有兼容的切位点限制酶允许你的插入物以正确的方向放置在主干上。例如,如果你要将一个基因克隆到一个表达载体中,你会希望该基因的起始点位于主链启动子的下游。理想情况下,主链将包含启动子下游的各种限制性内切酶切位点(restriction enzyme cut sites),作为启动子的一部分多克隆位点.有多个位点可以让你很容易地定位你的基因插入相对启动子

例如,让我们假设你的质粒主链看起来像下图左侧的质粒主链。它有一个启动子(蓝色箭头),后面是限制性位点EcoRI, XhoI和hindi。为了将你的基因放置在启动子下游的正确方向上,你可以在基因开始的5 '处添加一个EcoRI位点,在基因结束的3 '处添加一个HindIII位点。这样你就可以把质粒骨架以及插入和EcoRI HindIII,削减产品混合在一起时,两个EcoRI消化结束将退火和两个HindIII消化结束将退火留下的5 '末端基因启动子的下游,将在适当的方向。然后在混合物中加入连接酶,以共价键连接主干并插入,很快,你就得到了一个完整的质粒,可以用于你的实验。

结扎包括切割和分离碎片,退火和结扎

另外,整个过程可以使用单一酶完成如果你插入两侧有酶的限制性位点,但插入可以退火骨干在正向或反向方向你会需要一些方法来验证插入了你想要的方向——通常通过年代愤怒排序或进一步限制消化。

当然,这个过程还需要更多的细节和验证,所以让我们让我们一步一步地来了解细节。

浏览质粒可作为克隆级DNA!

1.消化

设置限制消化为您的插入(或供体质粒)和质粒主干。因为在凝胶纯化过程中会丢失一些DNA,所以消化大量的起始物质是很重要的。建议插入物1.5 ~ 2μg,质粒主干物1μg。同样重要的是,尽可能多的主质粒被两种酶切掉,因此消化直到完成是很重要的。完全消化所需的时间对不同的酶是不同的。许多公司现在都在销售快速消化酶,这种酶可以在10分钟内消化大量DNA,但要检查酶的制造商,确保你在适当的时间和使用适当的条件下切割。

箴提示!

如果你打算只使用一种限制性内切酶,或者在消化后有兼容的悬垂或没有悬垂的酶,你将需要使用磷酸酶来防止主质粒的再循环(见下文)。在结扎步骤或凝胶纯化步骤之前,应使用磷酸酶处理消化的主干质粒,具体取决于您选择的磷酸酶。CIP(小牛碱性磷酸酶)或SAP(虾碱性磷酸酶)是常用的。按照制造商的说明操作。

磷酸酶治疗可防止主干质粒的再循环

2.通过凝胶纯化分离插入物和载体

在琼脂糖凝胶上纯化未切割载体、切割插入物和切割载体现在你已经切断了插入和向量,不幸的是你不能把消化混合物扔在一起。你需要将你的插入物和主干物从用来消化它们的酶中分离出来,以及任何被切掉的部分。一个简单的方法是凝胶纯化。在凝胶纯化中,你使用凝胶基质(通常是琼脂糖)上的电压差将带负电荷的DNA拉过凝胶。如图所示,你消化后的DNA(和未消化的对照)被装载在凝胶的顶部,位于阴极(-电荷)的孔中。当在凝胶上施加电压时,DNA向阳极(+电荷)迁移。线性化的大片段比线性化的小片段迁移得慢。你可以通过不同的迁移速度将你的主干从任何插入物中分离出来,也可以将你的新插入物从任何被切断的悬垂物中分离出来;在运行凝胶一段时间后,这些不同大小的碎片将在不同的位置,可以分别从凝胶中切割出来。

有多种方法可以显示凝胶中的DNA(此表格不包括所有凝胶染色):

染色 跑步前还是跑步后? 可视化 灵敏度(ng DNA)
SYBR安全 前后 蓝色或紫外光 0.5
GelRed 前期及职位(推荐职位) 紫外线 0.1
GelGreen 前期及职位(推荐职位) 紫外线或绿色(~500nm)光 0.1
结晶紫 前后 可见光 One hundred.
亚甲蓝 帖子 可见光 One hundred.
溴化乙锭 前后 紫外线 0.5

有关这些污渍的更多信息,请参阅一口体积生物的博客以及他们的相关制造商网站。

这些污渍要求您要么在样品运行后对凝胶进行染色,要么在凝胶制作时添加染色剂(上表中运行后或运行前)分别)。上面的一些污渍需要你用紫外线来观察你的DNA——请注意,紫外线会损害DNA,使用紫外线观察时应该佩戴适当的个人防护装备,因为它会对眼睛和皮肤造成伤害。

当运行凝胶的纯化目的,它是重要的有漂亮的脆带和有空间去削减带。因此,我们建议您使用宽凝胶梳,在较慢的一边运行凝胶,并在样品之间跳过车道。除了DNA阶梯标准之外,如果你的消化不像预期的那样,运行每个质粒的未切割样本来帮助排除故障也是一个好主意。

一旦你将你的插入和受体质粒的主带从凝胶中剪切并纯化凝胶净化方法,很重要测定恢复DNA的浓度因为这对结扎步骤很有用。

3.结扎你的插入到你的向量

在结扎步骤中,混合纯化后的主质粒,切断主质粒并将其插入一个单管中,使限制性消化产生的兼容悬挑物彼此退火,形成一个完整的圆形质粒。然后添加DNA连接酶以ATP为代价将片段共价连接在一起(见下图,共价键用红色表示)。

将插入物与载体结扎

在标准的连接反应中,我们推荐大约100ng的总DNA。理想情况下,“受体质粒与插入质粒的比例”约为1:3。由于每种基因的碱基对数量各不相同,仅凭DNA浓度很难计算出这一点。一种方法是对你试图创建的每个质粒进行2个连接,使用不同比例的受体质粒插入。

建立无插入DNA的阴性对照连接反应是至关重要的。这将允许你确定多少菌落,你应该期望在转化由于背景再循环和污染的未切割质粒。

4.转换

变换你的结扎反应与你选择的菌株。按照制造商对你的感受态电池的说明。

对于大多数标准克隆,你可以将1-2μl的连接反应转化为感受态细胞,如DH5alpha或TOP10。如果使用更少的总DNA (<1ng)或如果你难以获得菌种,你可能想要使用能力更高的细胞。另外,如果你的最终产品是如果非常大(>10kb),你可能想要使用电活性细胞而不是更常见的化学活性细胞。

结扎后,至少应该执行两个转换:

1.控制转换包含与主干单独的结扎混合物;

2.含有插入物和主干的结扎混合物的转化。

成功和不成功结扎的样本结果如下。一个成功的结扎将有少数菌落在脊柱单独板和许多菌落在脊柱+插入板(或至少多于脊柱单独板)。不成功的连接通常会导致两个盘上的菌落很少(不成功的1),在一个单独的载体盘上有更多的菌落(不成功的2),或者每个盘上的菌落数量大致相等(不成功的3)。

可能的转换结果

如果你的脊柱板上有大量的菌落(大于或等于脊柱+插入,u如果上述第2和第3条不成功),你可以尝试在连接酶存在和不存在的情况下单独连接受体质粒。如果菌落是未切割的空质粒的结果,当你不添加连接酶时,你仍然会有菌落。如果菌落是受体质粒自连接的结果,当你添加连接酶时,你会看到明显更多的菌落。

如果你没有看到任何菌落,你应该进行一个积极的控制,以确保你的转化有效。您还应该验证您是否镀上了适当的抗生素,并尝试改变“受体质粒:插入”在结扎反应中。

5.纯化完成的质粒

质粒纯化

一旦你的结扎看起来成功了,你就需要挑选单个的菌落,并检查它们是否结扎成功。选择3-10菌落取决于背景菌落的数量在你的控制板(更多的背景,更多的菌落你将需要挑选)和培养过夜DNA纯化。你能做的最简单的纯化是迷你准备,但如果你需要大量的DNA,你需要做中期准备或马克西准备。在这些提纯过程中,你通常会溶解细菌;加入化学物质沉淀出高分子量的基因组DNA;通过结合质粒DNA并让其他物质通过的柱过滤剩下的质粒DNA;最后,用特定的缓冲液或水从柱中选择性地洗脱质粒DNA。有关更多细节,请参阅列制造商。找到columnless净化协议在我们的网站上

6.验证了质粒

限制性摘要质粒克隆验证净化DNA,进行诊断限制消化100-300ng的纯化DNA和你用来克隆的酶。用琼脂糖凝胶.你应该看到两个带子,一个和你的脊柱一样大,另一个和你的新插入物一样大(见右图)。如果您只使用一种酶或使用了兼容的外伸酶进行连接,那么您将需要验证插入物的方向。您可能希望为此目的设计一个诊断摘要。

理想情况下,一旦你知道你的质粒有一个适当大小的插入物,你应该把它发送给sanger测序使用引物将允许你阅读插入物。查看我们的帖子如何验证你的质粒为更多的细节。

一旦你的完整质粒被验证,你就可以开始实验了!


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