质粒101:二级纳米体工具箱

由贝丝学会主席

西方的屁股。elisa。免疫荧光。这些技术有什么共同点?它们通常都需要第二抗体,通常是小鼠或兔子的那种。虽然抗体肯定没有“损坏”,但它们的产生确实需要持续的动物牺牲。有没有替代的免疫检测方法?进入Görlich实验室及其抗小鼠和-RABBIT IGG次级纳米型工具箱。Nanobodies就像微小的抗体一样,如果不优于所有上述列出的分子技术的抗体,但也可以在细菌中表达并用常见的蛋白质纯化方法提取。阅读了解有关纳米级的更多信息,以及它们的结构和功能与IgG抗体相比,以及如何在实验室中使用它们。


结构的比较

如名称表明,纳米甲状腺均为较小的抗体。源自源自称为a的不寻常类型的IgG抗体重链抗体(HCAB)这是骆驼、大羊驼、羊驼和其他骆驼所特有的。就结构而言,hcab就像标准IgG的缩减版。下面是纳米体、HCab和传统IgG抗体结构的比较。

抗体和纳米体结构的比较

功能比较

强大但庞大:抗体的优势

抗体作为间接免疫检测工具的主要原因之一是其强大的信号强度。这种信号强度很大程度上是由于它们更大的尺寸(~10-15纳米),这允许发生以下情况:

一种)多重多克隆次级IgG可以与初抗体的不同表位结合。

b)每个抗体臂都有一个抗原结合位点,每个抗体共有2个结合位点。

C)IgG足够大,每个抗体上都可以有多个标记(图2中的绿色圆圈)。

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但是大是双刃剑。抗体的大尺寸在靶抗原和荧光标记之间产生更多距离,这可以降低超分辨率荧光显微镜的潜在图像分辨率。它们的大小也限制了它们穿透组织的能力。因为抗体很大,并且致二价,初级和二抗不能一起孵育,而不形成大的低聚物复合物。抗体也太大,不能在细菌中表达,这意味着它们的生产需要动物牺牲,并排除与报告酶的标签或融合的基因工程。

对于多色染色,在选择使用哪种抗体时必须仔细考虑。最好选择不同种类的一抗,或者至少是来自不同的IgG亚类,这样二抗只能识别一抗。这一过程可以避免直接使用抗体荧光团偶联,但这些通常比未偶联的一抗更昂贵。

试剂 优点 缺点
抗体
  • 二价
  • 多克隆
  • 可以用多个染料标记
  • 商用
  • 不是重组;要求动物祭祀
  • 糟糕的组织渗透
  • 由于标签位移较大,分辨率较低
  • 需要分别孵育1°和2°
  • 多色染色必须使用不同种类和/或1°不同的IgG亚类吗
  • 可能很贵
Nanobodies
  • 重组;不需要动物献祭吗
  • 良好的组织穿透
  • 可以用多个染料标记
  • 由于较低的标签位移导致更大的分辨率
  • 通过预结合到1°,可以跳过2°孵育
  • 单价
  • 单克隆
  • 目前只有抗兔和牧场版本
  • 不是商用

小但强大:纳米级的优点

虽然抗体一直是免疫检测的巨人,但纳米体可能更适合这项工作。作为单一结构域蛋白,它们可以在细菌中表达,使纳米体成为一种重组和可再生的抗igg试剂。它们的小尺寸也允许更好的组织穿透,并将荧光标记和目标抗原之间的距离减少到约2nm,这可以导致更高的分辨率的超分辨率显微镜。纳米体可以用多达3种染料标记,产生与标准IgG二抗相似的信号强度(Pleiner等人的图4A-C)。由于不同IgG亚类和不同种类之间的交叉反应性有限,纳米体可用于共定位标记多达3个靶点(Pleiner等人图4D)。

与大型二抗体不同,当温育时,小纳米型不会用一抗原发性抗体。在替补席上,这导致染色方案较短,因为通过将其与标记的纳米植物孵育,主要抗体可以“标记”。在该预孵育前步骤之后,可以将初生抗体 - 纳米体混合物添加到样品中,从而消除次级抗体孵育。见下面的图4A,以比较纳米级染色与抗体的两步染色的这种一步染色。

两步抗体染色与一步纳米体染色

纳米体还简化了多色染色实验,因为它们不需要使用来自不同IgG亚类的一级抗体。相反,你可以预先培养单个一抗与二级纳米体结合所需的荧光团。在下面的图4B中,即使用三种IgG1抗体染色细胞,也可能发生三重共定位。在应用于样本之前,抗体与与Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 568或Alexa Fluor 647结合的二级纳米体单独孵育。用这种多色染色工作流程进行染色,可以得到与单个靶细胞染色类似的定位模式(比较图4A和图4B中的纳米体染色)。

纳米体一步免疫染色

如何使用二级纳米体工具箱

您是否准备好开始使用纳米级以获得自己的研究?伟大的!Pleiner等。通过免疫羊驼,将HCAB抗体与其血清分离,并精细筛选,优化和表征几种抗小鼠和-RABBIT纳米甲状腺,为您进行了努力工作。如果您有兴趣,您可以了解更多有关纳米码的内容这篇评论。如果您只想使用Pleiner等人中描述的纳米型,则下面概述了产生纳米型甲状腺的关键步骤;不需要羊驼。

决定使用哪个Nanobody:

下表总结了Pleiner等人的目前可用的纳米级。在挑选次生纳米型之前,重要的是回顾你的主要抗体的一些特征:物种在其中提出,其IgG亚类。一旦您了解这两个问题的答案,请参阅此表以查找正确的纳米脚体供您的工作。

物种 抗体子类 Nanobody addgene质粒
兔子 N / A * TP897

PTP1183(1X半胱氨酸)

pTP955 (3 x半胱氨酸)

鼠标 IgG1. TP886 pTP943 (3 x半胱氨酸)
鼠标 IgG1. TP1107

pTP1112 (1 x半胱氨酸)

TP1122(3X半胱氨酸)

鼠标 IgG2A. TP1129 PTP1005(3X半胱氨酸)
鼠标 卡巴 TP1170

pTP1174 (1 x半胱氨酸)

PTP1172(3X半胱氨酸)

*兔子只有一个IgG亚类。

在细菌中表达纳米体:

表2还具有与质粒的链接,您需要在细菌中表达您的纳米粉末。请注意,纳米型进出1x和/或3x半胱氨酸品种。这是指纳米曲面的半胱氨酸位点的数量可用于特定标签的缀合(有关更多信息,请参见步骤4)。

用镍柱纯化纳米体:

溶解表达你的纳米体的细菌,并在镍柱上运行裂解液。纳米体将通过其n端His14-bdNEDD8标签与柱结合。经过几次清洗,该标签可以被bdNEDP1蛋白酶裂解,从而从柱中释放纯化的纳米体。bdNEDP1蛋白酶可以通过质粒生成pDG02583。

标记纳米级:

然后通过马来酰亚胺标记用荧光染料或HRP标记纯化的纳米级。当马来酰亚胺基团与巯基(-SH)形成共价键时,发生马来酰亚胺标记,例如在半胱氨酸中发现的。可以找到马来酰亚胺酰胺共轭的HRP在这里和几个maleimide-conjugated染料也可以在市场上买到。

马来西亚胺标记纳米级

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参考文献

1.Pleiner, T., Bates, M., & Görlich, D.(2017)。抗小鼠和抗兔IgG二级纳米体工具箱。细胞生物学杂志。PubMed.PMID: 29263082

2.Bates, M., Böhning, m.i., Chug, H., Görlich, D., Lee, C., Pleiner, T., Schliep, J.E., Stark, H., Trakhanov, S., & Urlaub, H.(2015)。纳米体:用于超分辨率成像的位点特异性标记、快速表位定位和天然蛋白复合物分离。eLife。PubMed.PMID: 26633879公共医学中心PMCID: PMC4755751

3. Muyldermans,Serge。“纳米级:天然单结构域抗体。”生物化学年度审查82(2013):775-97。PubMed.PMID: 23495938。

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额外资源

寻找单克隆一级抗体用于二级纳米体工具箱?检查美国国立卫生研究院发展研究杂交瘤银行(DSHB).1毫升含抗体杂交瘤上清液仅为40美元,明显低于市场上的抗体。

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